klotho蛋白、Caspase12蛋白在糖尿病肾病中的表达及意义

发布时间：2016-11-03 11:59

  本文关键词：klotho蛋白、Caspase12蛋白在糖尿病肾病中的表达及意义，由笔耕文化传播整理发布。

《河北医科大学》 2015年

klotho蛋白、Caspase12蛋白在糖尿病肾病中的表达及意义

常贯超  

【摘要】：糖尿病已成为全球性疾病,在世界人口死亡原因中位居第五位。糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症之一,愈来愈威胁着糖尿病患者的生存,成为终末期肾功能衰竭的主要原因之一。糖尿病肾病的发病机制极其复杂,是多种因素综合作用的结果,其中,肾小管上皮细胞微环境改变,多种刺激因子出现,是导致原来发育成熟的肾小管上皮细胞的损伤,发生死亡,从而出现大量蛋白尿的重要原因之一。Klotho(Kl)基因是Kuro-o等在1997年研究自发性高血压时发现的与衰老有关的基因,Klotho基因表达的蛋白在人和鼠均有膜结合型和分泌型两种形式,其中分泌型的表达量明显高于膜结合型,是其主要的活化形式。分泌型Klotho蛋白在抗衰老、抗氧化应激、易化离子通道方面发挥着重要的激素样作用。Klotho主要在肾脏和脑脉络膜中表达,尤以在肾皮质小管上皮细胞表达最强。Klotho在肾脏的高表达决定了其在肾脏疾病发生发展中可能发挥着特殊作用。内质网应激是细胞在抵抗应激过程中的重要机制之一,一定程度的内质网应激能激活多种保护机制,通过对内质网腔中未折叠或错误折叠蛋白质的清理和生成减少而有效保护细胞。但应激持续过强或过久时,保护机制不能与损伤相抗衡,最终引起细胞的凋亡。Caspase-12酶原的激活特异性的由内质网损伤引起,激活的Caspase-12切割并激活Caspase-9酶原,活化后的Caspase-9通过对Caspase-3酶原等Caspase效应分子的活化,切割多ADP聚合酶(PARP)和多种其它细胞内的底物,最终导致细胞凋亡。本研究拟通过建立Ⅱ型糖尿病实验动物模型,采用原位末端标记法、免疫组织化学法等技术,系统观察Ⅱ型糖尿病大鼠肾小管上皮细胞中Klotho蛋白和Caspase12蛋白表达的变化,进一步探讨糖尿病肾病的发生机制及防治措施。目的:观察在Klotho蛋白、Caspase12蛋白在大鼠Ⅱ型糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)肾小管上皮细胞中的表达及其可能作用。方法:健康雄性Wistar大鼠40只,体重180-220g,随机分为2组:正常对照组(16只),Ⅱ型糖尿病肾病模型组(DN)(24只)。正常对照组以标准大鼠饲料喂养(热量约为14KJ/g),DN组以高脂高热量饲料喂养(总热量约为20KJ/g)。饲养5周后,禁食12h,DN组大鼠给予腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30mg/kg,正常对照组大鼠腹腔注射等量的柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液。糖尿病大鼠成模的标准为:连续2次空腹血糖≥16.7mmol/L,胰岛素指数低于正常对照组,且有多饮、多食、多尿的大鼠纳入实验,未成模者剔除。STZ注射1周后(即实验第6周起),对照组和DN组大鼠均继续以原饲料喂养16周。实验期间进行以下检测:(1)每周称重一次;(2)每4周鼠尾采血测定空腹血糖;(3)分别于注射STZ前、注射STZ后一周、实验末取血测定空腹胰岛素、甘油三酯、总胆固醇,并计算胰岛素敏感指数(ISI);(4)实验末,留取肾脏标本称重,并进行病理学检查;(5)免疫组织化学检测Klotho蛋白和活化Caspase12蛋白的表达。结果:1一般情况比较:与对照组大鼠相比,DN组大鼠体重明显降低(P0.05),空腹血糖、血清甘油三酯和胆固醇水平显著升高(P0.05或P0.01),空腹胰岛素水平与对照组相比明显降低(P0.05);DN组胰岛素敏感指数(-6.41±0.38)较对照组(-5.81±0.38)明显下降(P0.01),胰岛素抵抗指数HOMO-IRI,DN组(28.86±12.05)明显高于对照组(15.76±5.84)(P0.05)。2肾脏病理学观察:HE染色观察对照组大鼠肾脏结构完整,皮髓界限清楚。肾小球体积正常,毛细血管袢分布规则;肾小管排列整齐,上皮细胞形态正常;DN组大鼠肾脏体积增大,皮质层稍增宽。光镜下部分肾小球体积增大;偶见肾小球出现结节性硬化;部分肾小球内纤维组织增生;部分肾小管细胞浊肿和空泡变性,部分肾小管细胞脱落,肾小管基底膜增厚;间质内出现纤维组织增生,炎细胞浸润及小动脉的硬化。PAS染色观察对照组大鼠肾小球体积正常,毛细血管袢排列整齐,系膜细胞和系膜基质分布规则;肾小管排列整齐,上皮细胞形态正常。DN组大鼠肾小球体积稍增大;小球中系膜细胞及系膜基质明显增多;部分肾小管细胞浊肿和空泡变性,肾小管基底膜明显增厚。3免疫组化法检测Klotho蛋白和Caspase12蛋白在肾小管上皮细胞中的表达:Klotho蛋白主要表达于肾近曲小管上皮细胞中,表现为胞质内出现棕黄色颗粒,对照组大鼠肾近曲小管细胞中普遍阳性表达;与对照组大鼠相比,DN组大鼠中肾脏中Klotho表达明显低于对照组(P0.01);Caspase12蛋白表达肾小球和小管细胞中,表现为细胞核黄染或胞质内出现棕黄色颗粒,对照组大鼠肾固有细胞中仅有微量表达,DN组大鼠肾脏中Caspase12阳性表达的细胞数和表达的灰度值均明显高于对照组(P0.01,P0.05);经相关分析,DN组大鼠Klotho蛋白和Caspase12蛋白在肾小管上皮细胞中的表达呈负相关(r=-0.643,P0.05)。4原位末端标记(TUENEL)法检测肾小管上皮细胞的凋亡:原位末端标记(TUENEL)法检测细胞的凋亡,凋亡的细胞表现为细胞核呈棕黄色,对照组大鼠肾小管上皮细胞中未见阳性表达,凋亡指数为(1.6±1.2),DN组大鼠肾小管上皮细胞中凋亡细胞明显增多,凋亡指数为34.6±5.2与对照组相比,有统计学意义(P0.01);结论:Klotho蛋白在Ⅱ型糖尿病大鼠肾小管上皮细胞表达明显减少,Caspase12蛋白在Ⅱ型糖尿病大鼠肾小管上皮细胞表达明显增加,且两者呈明显负相关;与此同时,肾小管上皮细胞凋亡明显增加,提示内质网应激介导的凋亡可能参与了糖尿病肾病的发生发展。

【关键词】：
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：

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