126对人肝细胞糖代谢影响的机制研究

发布时间：2016-11-04 13:59

  本文关键词：MicroRNA-126对人肝细胞糖代谢影响的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

《郑州大学》 2015年

MicroRNA-126对人肝细胞糖代谢影响的机制研究

胡志为  

【摘要】：背景随着生活节奏的加快,生活水平的提高,在人们的生活方式发生巨大变化的同时,代谢性疾病的发病率也在全世界范围内逐年攀升,其中糖尿病是代谢性疾病中最常见的一种。在2型糖尿病的发生发展过程中,肝脏、肌肉、脂肪等组织对胰岛素反应能力下降甚至抵抗胰岛素的作用,继而会引起一些如肥胖、多囊卵巢综合症、高脂血症及动脉粥样硬化等疾病。肝脏是糖代谢的重要器官,胰岛素主要通过胰岛素受体底物(IRS)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号传导通路影响肝脏的糖代谢,然而肝脏胰岛素抵抗的发病机制,目前仍不明确。Micro RNAs(mi RNAs)是一类短小的、非编码的微小RNAs,对维持机体自身稳态的平衡、疾病的产生和发展过程中有着重要影响,它们与靶信使RNA(m RNA)的3’非翻译区(3’-UTRs)结合,抑制编码蛋白基因的转录后表达。Micro RNA-126不仅在内皮细胞中含量丰富,在凋亡小体中的表达也很高,国内外的研究发现,在糖尿病动物模型以及在糖尿病患者的血浆中,Micro RNA-126的表达量明显降低,因此我们认为Micro RNA-126可能与糖尿病的发生与发展有联系。Regazzi等人提出Micro RNAs不仅可以作为早期疾病发生的标志物,而且还可以是细胞间传递信息的信使,导致疾病进展的原因,本实验将对Micro RNA-126对肝细胞糖代谢影响的机制进行研究。目的本研究通过对来源于肝脏的永生非肿瘤细胞系——张氏肝细胞转染Micro RNA-126类似物、抑制物及其阴性对照序列,改变细胞内Micro RNA-126的表达量,并测定转染后细胞内胰岛素信号传导通路中相关蛋白(IRS-1、PIK3R2、Akt-2、p-Akt-2)的表达水平,旨在探讨Micro RNA-126对人肝细胞糖代谢功能影响的机制。材料和方法1.用含有10%胎牛血清、1%青链霉素的培养基培养张氏肝细胞(Chang liver cell),置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。2.荧光显微镜下确定细胞的最佳转染条件:取对数生长期的张氏肝细胞以5×105/孔接种于24孔板中,细胞密度生长至70%时,用脂质体Lipofectamine2000转染不同浓度(20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L)的荧光标记的阴性对照序列(FAM-NC及inhibitor FAM-NC),6小时后在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光强度,确定细胞最佳转染浓度。3.将研究对象分为6组:Micro RNA-126类似物组、Micro RNA-126抑制物组、Micro RNA-126类似物阴性对照组、Micro RNA-126抑制物阴性对照组、转染试剂组和正常对照组。用脂质体Lipofectamine2000将人工合成核苷酸序列(Micro RNA-126类似物、Micro RNA-126抑制物、Micro RNA-126类似物阴性对照物、Micro RNA-126抑制物阴性对照物)分别转染至相应组细胞中,运用实时荧光定量PCR法(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测细胞中Micro RNA-126的相对表达量。4.运用Western blot法检测不同转染组细胞内胰岛素受体底物-1(IRS-1)、磷脂酰肌醇激酶p85β(PIK3R2)、蛋白激酶B-2(Akt-2)、磷酸化Akt-2(p-Akt-2)的蛋白表达水平。5.数据统计学的分析由SPSS 17.0统计软件进行,数据结果由均数±标准差(x±s)表示,数据进行正态性检验和方差齐性检验,并用单因素方差分析(one-way ANOVA)及t检验行数据统计学分析,当P0.05时表示数据之间的差异具有统计学意义。结果1.在荧光显微镜下观察发现,FAM-NC及inhibitor FAM-NC可以有效的转染张氏肝细胞,并且呈现浓度依赖性,80 nmol/L为最佳转染浓度。2.在Micro RNA-126类似物组中,细胞内Micro RNA-126的相对表达量较正常对照组显著增加(P0.05);其他组细胞中Micro RNA-126的相对表达量与正常对照组相比差异无统计学意义。3.在Micro RNA-126类似物组细胞中IRS-1、PIK3R2的相对表达量较正常对照组明显减少,其差异有统计学意义(均P0.05),其余各组细胞中IRS-1、PIK3R2的相对表达量间的差异无统计学意义(P0.05)。Micro RNA-126类似物组细胞Akt-2的磷酸化水平(p-Akt-2/Akt-2)较正常对照组明显降低(P0.05),其余各组中p-Akt-2/Akt-2较正常对照组相比差异无统计学意义(P0.05)结论Micro RNA-126通过作用于IRS-1/PIK3R2/Akt-2胰岛素信号传导通路影响肝细胞的糖代谢功能。

【关键词】：
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1
【目录】：

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