黄连素通过cAMP-PKA-钙离子通道促进胰岛素分泌的初步研究

发布时间：2018-04-05 08:24

  本文选题：黄连素　切入点：cAMP　出处：《天津医科大学》2016年硕士论文

【摘要】：目的黄连素(BBR),主要活性成分是一种生物碱,它可以有效的治疗2型糖尿病(T2DM)患者。大多研究表明:它改善胰岛素抵抗,而它对胰岛β细胞胰岛素分泌作用的影响还未明确。本研究在确定黄连素促进胰岛素分泌的同时,初步探讨c AMP-PKA-calcium channel通路在其中所起的调节作用。方法(1)培养大鼠胰岛素瘤细胞株INS-1 832/13;(2)黄连素不同浓度(1μM、5μM、10μM、20μM)干预细胞72小时;(3)采用3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliμM bromide(MTT)法检测细胞活性;(4)利用BD FACSAriaTM Cell Sorter检测细胞凋亡情况;(5)试剂盒提取细胞总RNA,应用实时定量聚合酶链反应(q PCR)检测细胞胰岛素合成、凋亡以及钙离子通道相关基因的表达,包括pdx1,ins1,ins2,bcl-2、cav1.2;(6)萃取及分离细胞膜蛋白和细胞浆蛋白,靶蛋白特性抗体检测蛋白表达的变化,包括L型钙离子通道(L-type calcium channel protein,Cav1.2)、AMPK、P-AMPK、CREB和P-CREB;(7)体内胶原酶注射,分离消化SD大鼠胰腺,体视镜下手工摘取大鼠胰岛,过夜培养后,黄连素不同浓度(1μM、5μM、10μM、20μM)干预,然后进行高糖刺激胰岛素分泌试验(glucose stimulated insulin secretion,GSIS),放免法检测胰岛的胰岛素分泌量;(8)试剂盒细胞c AMP含量测定。结果(1)MTT测定细胞活性的结果表明:BBR对INS-1 832/13细胞干预72 h后,细胞的活性未受到明显变化(与对照组相比p0.05);(2)BD FACSAriaTM Cell Sorter分析仪探测细胞凋亡的结果表现为:BBR干预(浓度分别为1μM、5μM、10μM、20μM)INS-1 832/13细胞72 h后,早期和晚期凋亡细胞的百分比总和分别为12.9%、13.2%、14.3%和15.6%,与对照组凋亡细胞的百分比总和13.9%相比,差异不明显,没有统计学意义(p0.05);(3)q PCR实验探测不同基因的m RNA表达水平表明:BBR干预72小时后(浓度同上),20μM BBR导致ins1和ins2 m RNA表达显著下降到47%和48%,差异显著,具有统计学意义(与对照组相比p0.01);其他的BBR干预浓度,1μM,5μM,10μM均没有对ins1、ins2 m RNA表达产生显著影响(与对照组相比p0.05);本实验所用BBR浓度没有对pdx1的转录水平产生明显的影响,(与对照组相比p0.05);(4)GSIS实验结果表明:2.5m M浓度的葡萄糖孵育大鼠胰岛后,各BBR浓度干预(同上述)均未对基础胰岛素分泌产生显著影响(与对照组比较p0.05);当葡萄糖孵育浓度提高到16.7m M时,BBR干预浓度为1μM、5μM及10μM时胰岛的胰岛素分泌量明显增加,差异显著,具有统计学意义(p0.05),但是当BBR浓度增至20μM时,胰岛的胰岛素分泌与对照组相比,没有明显的变化(p0.05);(5)q PCR实验结果显示:BBR(1μM、5μM、10μM)显著增加cav1.2的m RNA的表达(p0.01);(6)免疫印记方法表明:分别探测L型钙离子通道1.2(Cav1.2)和1.3(Cav1.3)揭示出INS-1 832/13细胞Cav1.2的含量高于Cav1.3;BBR干预(1μM、5μM、10μM)显著增加Cav1.2蛋白表达,而当BBR浓度为20μM时,未能增加Cav1.2蛋白表达量(p0.05),与q PCR实验结果取得一致;(7)细胞内c AMP含量测定结果显示:5μM和10μM的BBR干预72 h后,显著增加INS-1 832/13细胞中c AMP含量;(8)细胞信号传导通道相关实验表明:5μM和10μM浓度的BBR能明显增加P-AMPK的蛋白表达,干预组P-AMPK/AMPK比值高于空白对照组(p0.01);空白对照组、BBR干预组(5μM)、PKA激动剂Forskolin干预组,BBR+PKA激动剂Forskolin干预组、PKA抑制剂H89干预组以及BBR+H89干预组的对照实验提示出BBR、BBR+Forskolin刺激增加P-CREB和Cav1.2蛋白的表达,相反的,H89、BBR+H89处理细胞后,P-CREB和Cav1.2蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(与BBR干预组相比较p0.01)。结论BBR可能不是通过对细胞凋亡的抑制作用和增加胰岛素生物合成发挥促胰岛素分泌的作用,而可能是由于增加钙离子通道蛋白的表达。可能的分子途径包括c AMP-PKA-CREB通路。
[Abstract]:The purpose of berberine (BBR), the main active ingredient is an alkaloid, it can be effective in treating type 2 diabetes mellitus (T2DM) patients. Most of the research shows that it improves insulin resistance, and its effect on insulin secretion of islet beta cells is not clear. In this study, determine the Yellow even element promoting insulin secretion at the same time, preliminary study on the role of C in regulation of AMP-PKA-calcium channel pathway in the method. (1) in cultured rat insulinoma cell line INS-1 832/13; (2) different concentrations of berberine (1 M, 5 M, 10 M, 20 M) intervention cells 72 hours; (3) using 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2-H-tetrazoli M bromide (MTT) assay cell activity; (4) using BD FACSAriaTM Cell Sorter to detect cell apoptosis; (5) cell total RNA extraction kit, using real-time quantitative polymerase chain reaction (Q PCR) to detect cell apoptosis and insulin synthesis. The expression of calcium channel genes including PDX1, ins1, Ins2, Bcl-2, Cav1.2; (6) the extraction and separation of membrane proteins and cytoplasmic proteins, changes in protein expression characteristics of target protein antibody detection, including L type calcium channel (L-type calcium channel protein, Cav1.2), AMPK, P-AMPK, and CREB P-CREB; (7) by injection of collagenase digested pancreatic body, SD rats under stereoscope manual removal of rat islets after overnight culture, different concentrations of berberine (1 M, 5 M, 10 M, 20 M) intervention, then glucose stimulated insulin secretion test (glucose stimulated insulin secretion, GSIS), radioimmunoassay of islet insulin secretion; (8) the content of AMP cell C assay kit. Results (1) MTT cell activity was determined by the results showed that the BBR of INS-1 in 832/13 cells after treatment for 72 h, the cell activity was not significantly affected by changes (compared with the control group (2 P0.05); BD FACSAriaTM) Cell Sorter鍒嗘瀽浠�鎺㈡祴缁嗚優鍑嬩骸鐨勭粨鏋滆〃鐜颁福�

本文编号：1713953