利拉鲁肽对人脐带间充质干细胞增殖、凋亡、分化的影响研究

发布时间：2018-04-28 19:43

  本文选题：利拉鲁肽 + 人脐带间充质干细胞　； 参考：《福建医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：目的:1、体外观察利拉鲁肽(liraglutide,Lira)对人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)增殖、凋亡的作用,并比较其与胰升糖素样肽-1(glucagon like peptide 1,GLP 1)作用效果的差异。2、体外观察利拉鲁肽对h UC-MSCs增殖、凋亡的作用,并对其与PI3K/Akt通路的关系进行初步探讨。3、采用高糖、尼克酰胺、利拉鲁肽三步法诱导h UC-MSCs分化为胰岛素分泌细胞(insulin producing cells,IPCs),并观察利拉鲁肽对h UC MSCs分化的影响。方法:1、取h UC-MSCs种植到25cm2培养瓶中,2-3天换一次液,待细胞融合度达到60 70%时,分为三组:正常细胞对照组,未做任何处理;GLP-1组,按浓度梯度1:10比例配制成10-9、10-8、10-7mol/L三种浓度;利拉鲁肽组(Lira组),按浓度梯度1:10比例配制成10-9、10-8、10-7mol/L三种浓度;分别加入GLP 1或利拉鲁肽培养24h、48h,采用Cell Counting Kit 8(CCK-8)法测定GLP 1和利拉鲁肽组h UC-MSCs的增殖能力,Annexin V FITC/PI流式细胞术检测GLP 1和利拉鲁肽组的凋亡率,并比较利拉鲁肽与GLP-1作用效果之间的差异。2、取对数生长期h UC-MSCs种植到25cm2培养瓶中,待细胞融合达度到60 70%时,分为四组:正常细胞对照组,未做任何处理;利拉鲁肽组(Lira组),添加利拉鲁肽干预h UC-MSCs 24h;LY294002组(LY组),添加20μmol/L的PI3K/Akt通路抑制剂LY294002干预h UC-MSCs 24h;利拉鲁肽+LY294002组(Lira+LY组),用20μmol/L LY294002预处理细胞2h后,添加利拉鲁干预h UC-MSCs 24h。采用ELISA法检测各组细胞上清液中环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)的浓度,Western Blot技术检测各组细胞p Akt、Akt蛋白的表达水平。3、采用高糖、尼克酰胺、利拉鲁肽三步法诱导P5代h UC-MSCs分化为IPCs。具体方法:先采用含25mmol/L高糖的HG-DEME培养基培养细胞10天;然后换为加入10mmol/L尼克酰胺的LG-DEME培养基培养细胞7天;最后用添加10-8mol/L利拉鲁肽的LG-DEME培养基培养细胞7天。倒置显微镜下动态观察诱导前及分化过程中细胞形态的变化,采用双硫腙(dithizone,DTZ)染色法鉴定IPCs,ELISA法测定各诱导阶段末细胞上清液中胰岛素的浓度及高糖刺激前后细胞上清液中胰岛素的浓度,Western Blot法检测各阶段细胞胰腺十二指肠同源盒1(pancreatic duodenal homeobox 1,PDX-1)、Insulin蛋白的表达水平。结果:1、GLP-1和Lira各浓度组作用细胞24h后,与各自的对照组比较,Lira 10-9mol/L浓度组增殖力增高,但差异无统计学意义(P0.05);GLP-1和Lira余各浓度组增殖力均增高(P0.05),与各自的对照组比较,GLP-1和Lira各浓度组凋亡率均降低(P0.05)。不同浓度组相互比较,GLP-1各浓度组增殖力相互比较,差异无统计学意义(P0.05);凋亡率相互比较,与GLP-1 10-9mol/L浓度组凋亡率比较,GLP-110-8mol/L与10-7mol/L浓度组凋亡率均降低(P0.05),与GLP-1 10-8mol/L浓度组凋亡率比较,GLP-1 10-7mol/L浓度组凋亡率降低,但差异无统计学意义(P0.05);Lira各浓度组间增殖力、凋亡率分别相互比较,差异均有统计学意义(P0.05),其中Lira 10-7mol/L浓度组增殖力最高,凋亡率最低。作用细胞48h后,GLP-1和Lira10-9mol/L浓度组增殖力分别与各自的对照组比较,差异无统计学意义(P0.05);与各自的对照组比较,GLP-1 10-8mol/L浓度组增殖力增高,但差异无统计学意义(P0.05);Lira 10-8mol/L浓度组增殖力增高(P0.05);GLP-1和Lira 10-7mol/L浓度组增殖力均增高(P0.05);GLP-1和Lira各浓度组凋亡率分别与各自的对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05);GLP-1各浓度组增殖力相互比较,与GLP-110-9mol/L浓度组比较,GLP-1 10-8mol/L浓度组增殖力增高,但差异无统计学意义(P0.05);GLP-1 10-7mol/L浓度组增殖力增高(P0.05);与GLP-1 10-8mol/L浓度组比较,GLP-1 10-7mol/L浓度组增殖力增高,但差异无统计学意义(P0.05);Lira各浓度组间增殖力相互比较,与Lira 10-9mol/L浓度组比较,Lira 10-8mol/L与10-7mol/L浓度组增殖力均增高(P0.05);与Lira 10-8mol/L浓度组比较,Lira10-7mol/L浓度组增殖力增高,但差异无统计学意义(P0.05)。GLP-1和Lira各浓度组凋亡率分别相互比较,差异均有统计学意义(P0.05)。按照细胞活力公式计算Lira各浓度组细胞活力,Lira组同一浓度在不同时间点的增殖活力比较,Lira各浓度组分别作用48h后的增殖活力较作用24h后的增殖活力均降低,差异有统计学意义(P0.05)。2、干预h UC-MSCs 24h后,与对照组比较,Lira浓度组c AMP的浓度明显增高(P0.05),LY组c AMP的浓度明显降低(P0.05),Lira+LY组的浓度降低,但差异无统计学意义(P0.05)。与Lira组比较,LY组与Lira+LY组c AMP的浓度均明显降低(P0.05);与LY组比较,Lira+LY组c AMP的浓度明显增高(P0.05)。Western Blot法结果显示:干预h UC-MSCs 24h后,与对照组比较,Lira组P-AKT蛋白的表达量增加(P0.05),LY组、Lira+LY(12h)组和Lira+LY(24h)组P-AKT蛋白的表达量均降低(P0.05);与LY组比较,Lira+LY(12h)组与Lira+LY(24h)组P-AKT蛋白的表达量均增加(P0.05);与Lira+LY(12h)组比较,Lira+LY(24h)组P-AKT蛋白的表达量降低(P0.05)。3、倒置显微镜下观察细胞形态,诱导前h UC-MSCs为长梭形;一阶段诱导后,细胞开始聚集,成“集束状”排列;二阶段诱导后,细胞开始悬浮生长,聚集成团,细胞形态开始改变,出现圆形细胞;三阶段诱导后,细胞团数量明显增多。DTZ染色结果显示:诱导前及一阶段末细胞DTZ染色阴性,二阶段末部分细胞团DTZ染色阳性,三阶段末,DTZ阳性细胞团数量明显增加。ELISA检测结果显示:一阶段末,细胞上清液中胰岛素的浓度微量,二阶段末及三阶段末细胞上清液中胰岛素浓度逐渐增高。诱导前及一阶段诱导后,细胞对高糖刺激无反应(P0.05),二阶段和三阶段诱导后,细胞对高糖刺激反应明显(P0.05)。Western Blot结果显示:诱导前PDX-1、Insulin蛋白表达阴性,诱导后PDX-1、Insulin蛋白表达水平逐渐增加。结论:1、利拉鲁肽与GLP-1均可以促进h UC-MSCs增殖、抑制其凋亡,且利拉鲁肽的作用效果较好,且可能通过激活PI3K/Akt通路发挥作用。2、利拉鲁肽可以上调h UC-MSCs内c AMP的浓度,并且可以阻断LY294002对h UC-MSCs分泌c AMP的抑制作用。3、体外采用高糖、尼克酰胺、利拉鲁肽三步法可以诱导h UC-MSCs细胞分化为成熟的IPCs。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1

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