ERK信号转导通路在SLE表观遗传学基因表达调控机制及骨桥蛋白在SLE肾损害中的作用

发布时间：2018-05-06 18:40

  本文选题：系统性红斑狼疮 + DNA甲基化　； 参考：《南方医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种常见的累及多系统、多器官的自身免疫性疾病。以DNA甲基化异常为核心的表观遗传学异常是SLE发病的主要因素。研究发现,SLE患者T细胞中DNA甲基转移酶-1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)基因表达及酶活性下调,CD70等基因的启动子去甲基化导致相关基因过度表达。ERK信号转导通路特异性抑制因子可抑制T细胞DNMT1基因表达及酶活性,从而引起与狼疮T细胞类似的免疫紊乱,而该信号转导通路缺陷正好也在狼疮T细胞中存在。此外,细胞因子分泌和复杂调控网络的异常是SLE免疫紊乱发生和各系统、器官的慢性炎症及器官损害的直接原因。Th17细胞(T helper cell 17,辅助性T细胞17)通过其主要效应分子白介素(interleukin, IL)-17对SLE靶器官炎症反应的增强作用,进而促进了靶器官的炎性损伤和SLE的发生发展。特别是SLE肾损害患者中,Th17细胞异常活化并且过度分泌IL-17起着重要作用。但是,SLE肾损害Th17细胞异常活化和分泌IL-17的确切机制还不完全清楚。近来的研究发现,骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)作为Th17细胞异常活化和炎性因子分泌的重要调控器,在SLE疾病发生和靶器官炎性损伤中,特别是SLE肾损害中起着重要作用。第1部分ERK信号转导通路在SLE患者表观遗传学基因表达调控机制研究背景以DNA甲基化为核心的表观遗传学特征异常是SLE发病的重要因素。我们的前期研究发现SLE患者T细胞DNMT1基因表达减少和酶活性下降,CD70、IL-6等基因启动子甲基化程度降低,并导致该基因过度表达。SLE患者T细胞中ERK信号转导通路缺陷可能在SLE表观遗传学特征异常中起关键作用。最近文献报道,特异性ERK信号通路抑制剂可以抑制正常T细胞的DNMT1基因表达及酶活性并进而出现类似狼疮T细胞的免疫异常,而ERK信号转导通路活性降低正好也在狼疮T细胞中存在。故推测SLE患者T细胞中ERK信号转导通路缺陷可能在SLE表观遗传学特征异常中起关键作用。因此,我们拟利用流式、酶联免疫、蛋白印迹、实时荧光定量PCR等技术研究体内狼疮T细胞中ERK信号转导通路和表观遗传学特征异常的内在联系,用特异性ERK信号通路抑制剂、DNMT抑制剂处理T细胞研究体外ERK信号转导通路对狼疮T细胞表观遗传学特征的影响,从而进一步完善SLE发病机制中表观遗传学理论,为治疗SLE提供新思路和新靶点。研究目的通过研究红斑狼疮患者体内ERK信号转导通路与T淋巴细胞表观遗传学异常的内在联系以及体外ERK信号转导通路对正常人T淋巴细胞表观遗传学特征的影响,探讨ERK信号转导通路在以DNA甲基化为核心的表观遗传学基因表达调控机制中的作用,进一步完善SLE发病机制中表观遗传学基因表达调控机制理论,为研究信号转导通路对表观遗传学基因表达调控机制的影响提供新的思路,填补国内外研究的空白,也为系统性红斑狼疮这一自身免疫性疾病的治疗提供新策略和新靶点。研究方法1.依据1997年修订的SLE分类诊断标准,分别收集10例SLE患者作为实验组和10例临床资料匹配的健康体检者作为对照组；2.收集实验组和对照组外周血,先用Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),用免疫磁珠(Immunomagnetic beads,IMB)分离技术分选CD4+T细胞,采用流式细胞技术(flow cytometry,, FCM)检测分选的CD4+T细胞百分比；3.实验组和对照组分选出的CD4+T细胞,分别用Trizol一步法和RIPA裂解液提取总RNA、DN、.蛋白质,储存备用；4.设计人ERK1、DNMT1和CD70PCR引物,将提取的总RNA经逆转录RCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)扩增,分析基因mRNA表达水平；5. 以5甲基胞嘧啶作为DNA甲基化的生物标志物,利用印迹法DNA甲基化定量试剂盒(sigma, MDQ1, Amecica)检测提取DNA的甲基化水平；6.用蛋白质印迹(Western blot)法检测ERK1、DNMT1和CD70蛋白水平；7.采用IMB技术分离的人CD4+T细胞,分为ERK抑制组、DNNT抑制组、SLE和正常对照组共4组,分别加入特异性ERK抑制剂(U0126)、DNA甲基转移酶抑制剂(氮杂胞苷)共培养72小时,而正常对照组未经任何处理。后续实验内容同前4、5和6。结果1.狼疮T细胞中存在DNA甲基转移酶表达下调和DNA低甲基化。SLE患者外周血T细胞的DNA甲基转移酶基因1表达显著低于健康对照组；2.系统性红斑狼疮患者外周血T细胞过度表达甲基化调控基因CD70。我们用Western Blot、RT-PCR等方法发现, SLE患者CD70表达水平较正常人显著增加；3.DNA甲基化可以调控多种甲基化敏感基因表达。特异性DNA甲基化抑制剂氮杂胞苷与人外周血CD4+T细胞共培养可导致新合成的DNA甲基化水平明显下降,DNA甲基化敏感基因CD70表达上调；4.狼疮T细胞基因表观遗传学调控机制异常与ERK1信号转导通路相关。选择性有丝分裂原活化蛋白/细胞外信号调节激酶抑制剂U0126抑制正常T细胞ERK途径,减少T细胞DNMT1 mRNA和蛋白表达水平,诱导DNA低甲基化,进而调控甲基化敏感基因CD70表达。结论以DNA甲基化为核心的表观遗传学基因表达调控机制在SLE疾病发生发展中起着重要作用第2部分ERK信号转导通路在MRL/lpr鼠表观遗传学基因表达调控机制中的作用探讨研究背景以DNA甲基化为核心的表观遗传学特征异常是SLE发病的重要因素。我们的研究发现SLE患者T细胞DNMT1基因表达减少和酶活性下降,CD70、IL-6等基因启动子甲基化程度降低,并导致该基因过度表达。最近文献报道,特异性ERK信号通路抑制剂可以抑制正常T细胞的DNMT1基因表达及酶活性并进而出现类似狼疮T细胞的免疫异常,而ERK信号转导通路活性降低正好也在狼疮T细胞中存在。故推测SLE患者T细胞中ERK信号转导通路缺陷可能在SLE表观遗传学特征异常中起关键作用。因此,我们拟利用流式、酶联免疫、蛋白印迹、荧光定量聚合酶链式反应等技术研究MRL/1pr鼠T细胞中ERK信号转导通路和表观遗传学特征异常的内在联系,用特异性ERK信号通路抑制剂、DNMT抑制剂处理T细胞研究体外ERK信号转导通路对MRL/1pr鼠T细胞表观遗传学特征的影响,从而进一步完善SLE发病机制中表观遗传学理论,为治疗SLE提供新思路和新靶点。研究目的通过研究MRL/1pr鼠体内ERK信号转导通路与T淋巴细胞表观遗传学异常的内在联系以及体外ERK信号转导通路对T淋巴细胞表观遗传学特征的影响,探讨ERK信号转导通路在以DNA甲基化为核心的表观遗传学基因表达调控机制中的关键作用,进一步完善SLE发病机制中表观遗传学基因表达调控机制理论,为研究ERK信号转导通路对表观遗传学基因表达调控机制的影响提供新的思路。研究方法1.分别将10只MRL/lpr鼠和10只健康BALB/c小鼠作为动物实验的实验组和对照组；2.收集实验组和对照组脾脏单个核细胞,用免疫磁珠分离技术分选鼠CD4+T细胞,采用流式细胞技术(flow cytometry, FCM)检测所分选的CD4+T细胞百分比；3.采集鼠实验组和对照组外周血,先用Ficoll密度梯度离心法分离出单个核细胞(PBMC),再用免疫磁珠分离技术分选鼠CD4+T细胞,分别提取总RNA、DNA、蛋白质,储存备用；4.设计小鼠ERK1、DNMT1和CD70引物,将提取的总RNA经逆转录RCR扩增,分析各目的基因mRNA表达水平；5.以5甲基胞嘧啶作为DNA甲基化的生物标志物,利用印迹法DNA甲基化定量试剂盒(sigma, MDQ1,Amecica)检测提取的DNA的甲基化水平；6.用蛋白质印迹(western blot)检测ERK1、DNMT1和CD70蛋白水平；7.采用IMB技术分离的鼠CD4+T细胞,分为ERK抑制组、DNNT抑制组、SLE和正常对照组共4组,分别加入特异性ERK抑制剂(U0126)、DNA甲基转移酶抑制剂(氮杂胞苷)共培养72小时,而正常对照组未经任何处理。后续实验内容同前4、5、6。结果1. MRL/1pr鼠T细胞中存在DNA甲基转移酶表达下调和DNA低甲基化。MRL/1pr鼠外周血T细胞的DNA甲基转移酶基因1表达显著低于健康对照组；2. MRL/1pr鼠外周血T细胞过度表达甲基化调控基因CD70。我们用Western Blot、RT-PCR等方法发现,MRL/1pr鼠CD70表达水平较健康对照组显著增加;3.DNA甲基化可以调控多种甲基化敏感基因表达。特异性DNA甲基化抑制剂氮杂胞苷与MRL/1pr鼠外周血CD4+T细胞共培养可导致新合成的DNA甲基化水平明显下降,DNA甲基化敏感基因CD70表达上调；4.狼疮T细胞基因表观遗传学调控机制异常与ERK1信号转导通路相关。选择性有丝分裂原活化蛋白/细胞外信号调节激酶抑制剂U0126抑制正常T细胞ERK途径,减少T细胞DNMT1 mRNA和蛋白表达水平,诱导DNA低甲基化,进而调控甲基化敏感基因CD70表达。结论以DNA甲基化为核心的表观遗传学基因表达调控机制在SLE疾病发生发展中起着重要作用第3部分骨桥蛋白在SLE肾损害Th17细胞异常中的作用研究背景系统性红斑狼疮是一种以多种炎性细胞因子参与的多靶器官损害为特征的自身免疫性疾病。特别是系统性红斑狼疮肾损害,免疫复合物形成、免疫细胞和细胞因子等免疫异常导致的靶器官细胞浸润和炎性损伤是其发病的关键因素。Th17细胞及其分泌的多种炎性细胞因子在SLE疾病的免疫紊乱及器官的炎性损伤中有非常重要的作用。有学者发现,SLE患者外周血及受累器官Thl7细胞及IL-17均高表达。而且在SLE活动期其表达更高,而经过治疗后其表达有所降低。另外的学者则发现,不仅SLE患者IL-17的分泌增加和分泌IL-17的CD4+和CD3 CD4 CD8T细胞增多,而且分泌IL-17的Th17细胞也存在于SLE患者炎性损伤的肾组织中。研究目的通过研究SLE肾损害患者OPN对CD3+CD8-IL-17A+T细胞及IL-17分泌的影响,探讨OPN在SLE肾损害患者Th17细胞异常中的作用。方法分别取40例健康人和50例SLE患者(其中,伴肾损害SLE患者25例、无肾损害的SLE患者25例)血清和肝素钠抗凝血,用酶联免疫吸附试验法检测血清中OPN和IL-17的表达水平,用流式细胞术检测外周血中CD3+CD8-IL-17A+T细胞的阳性率,并分析各组间差异,以及各因素间的相互关系。结果①SLE肾损害患者组的OPN、IL-17水平和CD3+CD8-IL-17A+ T细胞阳性率显著高于无肾损害的SLE患者组、健康对照组,差异有统计学意义(F值分别为42.032,25.768,58.878,p均0.01)；无肾损害的SLE患者组和健康对照组间OPN、IL-17、CD3+CD8-IL-17A+T细胞阳性率的差异无统计学意义(F值分别为42.032,25.768,58.878,P均0.05)。②血清中OPN分泌与IL-17水平、CD3+CD8-IL-17A+T细胞阳性率之间成明显正相关(R值分别为0.442、0.630,P值均0.01)。结论外周血中的OPN对SLE肾损害患者的Th17细胞异常起着重要的调控作用。
[Abstract]:Systemic lupus erythematosus ( SLE ) is one of the most common causes of systemic lupus erythematosus ( SLE ) . In order to provide new strategies and targets for the treatment of autoimmune diseases in systemic lupus erythematosus , 10 SLE patients were collected as experimental groups and 10 healthy subjects as control groups , according to the revised SLE classification criteria in 1997 .
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本文编号：1853427