重组融合蛋白SAK-HV降脂机制研究

发布时间：2018-05-21 04:35

  本文选题：高脂血症 + 肝脏脂肪沉积　； 参考：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年博士论文

【摘要】：脂代谢紊乱是心脑血管疾病和代谢综合征的病理基础。特别是脂质在血液和肝脏中的过多积累会导致高脂血症和非酒精性脂肪肝的形成,在全世界范围内严重影响人类健康。我实验室在国家科技重大专项重大新药创制项目(2009ZX09103-623,2012ZX09102301-017)的资助下研制开发了抗动脉粥样硬化(AS)的新型重组融合蛋白SAK-HV。SAK-HV由SAK突变体、RGD序列和水蛭素C端12肽构成,具有溶栓、抗凝和抑制血小板聚集的复合功能;在多种AS动物模型中均发挥了良好的抗AS疗效。同时,我们发现SAK-HV可显著地降低血胆固醇和甘油三酯水平,并明显改善肝脏脂肪沉积。特别是在给药14-21天观察期内,SAK-HV降低胆固醇的效果显著优于上市药物阿托伐他汀。本研究深入探索SAK-HV降脂机制,并在体外实验过程中意外发现其对巨噬细胞具有促增殖作用。因此,本研究分为两个部分:第一部分作为研究主体深入探索SAK-HV降脂机制,为治疗高脂血症和非酒精性脂肪肝提供新靶点和新思路;第二部分作为拓展研究初步阐明SAK-HV促巨噬细胞增殖机制,为进一步了解SAK-HV的药物机制奠定了基础。第一部分SAK-HV降脂机制研究本研究第一部分结合转录组分析以及一系列体内外实验深入研究该蛋白降脂机制。量效分析表明,SAK-HV在高脂喂养的ApoE-/-小鼠中降血脂量效关系呈现独特的非剂量依赖的U型曲线。时效分析显示其降脂效应具有延时突发和迅猛的特性。SAK-HV有效减轻肝脏脂肪沉积,并降低肝、血炎症,且未造成任何肝脏或出血病变产生。同时,在观察期14天内SAK-HV降脂效果显著优于阿托伐他汀。在较阿托伐他汀具有相似的抗氧化应激效果的同时,SAK-HV可以更加有效地改善肝功能指标。由于SAK-HV在肝和血中均可以有效降脂,且肝脏是参与脂代谢的关键器官,我们推测肝脏可能是SAK-HV发挥降脂效应的主要靶器官之一。对ApoE-/-小鼠肝脏转录组芯片的基因差异表达分析提示SAK-HV诱导补体介导了肝细胞增殖,从而增加能量和物质需求,最终造成包括PPAR信号通路激活在内的脂代谢改变;并提示PGC-1α可能介导了肝脏类固醇激素合成过程,该过程与降低的血TC存在潜在的关联。权重基因共表达分析WGCNA挖掘出肝脏中补体介导的STAT3-C/EBPβ-PGC-1α新通路可能构成了 SAK-HV的一条关键降脂途径。我们通过一系列体内指标检测验证并拓展转录组分析结果。实验证实SAK-HV在给药7～14天之间触发了经典途径补体激活;同时激活了潜在降脂新通路STAT3-C/EBPβ-PGC-1α,有效改善肝脏脂肪沉积,并触发了适度的肝增殖。另一方面,实验结果还显示肝脏脂肪酸氧化代谢被增强,并证实孕、雌激素合成代谢的增强导致它们在肝脏水平的显著升高。此外,我们还检测到SAK-HV增强了肝脏中LDLr介导的胆固醇吸收,且未对胆固醇分解、排泄途径造成显著影响。因此,我们初步提出假说:SAK-HV通过耗能的肝细胞增殖降低血脂,肝脏中补体介导的STAT3-C/EBPβ-PGC-1α构成了该蛋白一条新颖的降脂通路,其中PGC-1α可能介导了肝脏雌激素胞内分泌,在降脂过程中发挥了潜在的作用。PGC-1α慢病毒敲低抑制了 SAK-HV对孕、雌激素合成途径的增强作用,从而有效阻断了 SAK-HV处理后肝脏中孕、雌激素水平的升高。该结果证实PGC-1α在肝增殖过程中介导了孕、雌激素的胞内分泌。雌激素合成抑制剂来曲唑以及PGC-1α敲低均有效阻断了 SAK-HV促肝增殖效应,显著抑制了 SAK-HV降血脂及改善肝脏脂肪沉积的疗效。来曲唑部分抑制了 SAK-HV增强的PPARα脂肪酸氧化,并阻断了其通过LDLr介导的肝脏胆固醇吸收。PGC-1α敲低造成了SAK-HV给药后肝TG水平较模型组的升高,这可能是由于肝脏增殖早期储能过程中转瞬的肝脏脂肪积累造成的;但是该现象在雌激素抑制实验中并未发现,表明PGC-1α在没有雌激素作用的情况下仍然部分降低了肝TG水平。换而言之,雌激素对PGC-1α介导的降脂作用起到了放大的作用。类似地,PGC-1α敲低几乎完全抑制了 PPARα脂肪酸氧化,而非来曲唑造成的部分抑制,进一步证实了雌激素对PGC-1α诱导的PPARα脂肪酸氧化的放大作用。研究表明PGC-1α-雌激素代谢轴构成了肝增殖过程中一个新颖的能量模型。染色质免疫共沉淀ChIP实验证实SAK-HV处理分别增强了 STAT3与C/EBPβ启动子,以及C/EBPβ与PGC-1α启动子的结合;STAT3磷酸化抑制剂STATTIC显著抑制了 SAK-HV潜在降脂新通路STAT3-C/EBPβ-PGC-1α,并有效阻断了 SAK-HV降血脂和改善肝脏脂肪沉积的疗效。本研究证实肝脏中STAT3-C/EBPβ-PGC-1α通路构成了一条新颖的降脂途径。已有研究证实补体激活的IL-6-STAT3通路在肝增殖过程中发挥了关键作用,其激活水平与肝增殖速率呈正比。我们利用补体抑制剂FUT-175和C3敲除分别有效减弱了 SAK-HV处理后ApoE-/-小鼠及C3-/-小鼠血C5α和IL-6的上调作用,显著抑制下游STAT3-C/EBPβ-PGC-1α降脂通路,并阻断了 SAK-HV触发的肝脏增殖效应。补体抑制还破坏了 SAK-HV在ApoE-/-小鼠中的降血脂及改善肝脏脂肪沉着的疗效。通过SAK-HV在体外刺激小鼠胚胎肝细胞BNL-C12,表明脱离了补体激活,SAK-HV处理无法导致BNL-C12细胞周期的改变,且无法激活STAT3-C/EBPβ-PGC-1α通路。这些体内外结果充分证实补体在SAK-HV降脂效应中的关键作用。已有研究表明PPARα可以介导C3转录升高。但PGC-1α敲低造成的PPARα抑制在ApoE-/-小鼠中并未显著影响SAK-HV触发的补体激活水平,进一步证明补体激活是SAK-HV触发降脂效应的原因,而非结果。综上所述,第一部分研究证实PGC-1α在肝增殖过程中参与肝脏孕、雌激素合成;并提出补体在肝脏经由STAT3-C/EBPβ-PGC-1α新降脂通路诱导的PGC-1α-雌激素代谢轴构成了新颖的肝脏增殖能量模型。该模型中,PGC-1α作为“点火器”点火并供能肝细胞激活;PGC-1α诱导的雌激素作为“点火放大器”放大PGC-1α的能量供应,并作为“启动装置”触发肝细胞从激活到增殖的状态跃迁;该过程通过PPARα脂肪酸氧化消耗血、肝TG供能,并通过LDLr介导的肝脏胆固醇吸收降低血TC。SAK-HV基于该肝增殖能量模型的独特降脂新策略有潜力成为治疗非酒精性脂肪肝、高胆固醇血症以及高甘油三酯血症的新型短周期生物疗法。同时,该能量模型的提出也为肝增殖过程的脂代谢研究提供了新的启示。第二部分SAK-HV促巨噬细胞增殖机制研究第一部分研究表明SAK-HV在体内具有促肝细胞增殖效应。巨噬细胞和血管内皮细胞增殖是AS致病的关键因素。因此,我们在第一部分体外研究SAK-HV促肝细胞增殖机制的过程中,同时观察了该抗AS蛋白对巨噬细胞和血管内皮细胞是否具有促增殖效应。结果显示SAK-HV对小鼠胚胎肝细胞BNL-CL2和小鼠主动脉内皮细胞MAEC增殖无显著影响,却意外地有效增强了小鼠巨噬细胞RAW264.7、人类单核细胞THP-1以及小鼠腹腔原代巨噬细胞的增殖效应。研究表明SAK-HV具有促巨噬细胞增殖特性。因此本研究在阐明SAK-HV降脂机制之后又进行了额外拓展,进一步通过RAW264.7细胞和小鼠腹腔原代巨噬细胞探索SAK-HV促巨噬细胞增殖机制。我们首先筛查SAK-HV促增殖通路。结果表明SAK-HV处理RAW264.7细胞激活了增殖相关通路PI3K以及MAPKP38,JNK和ERK。通过抑制上述激活通路筛选出JNK和ERK MAPK是SAK-HV促巨噬细胞增殖效应的关键通路,并证实了它们在SAK-HV处理后原代巨噬细胞中的活化。我们继而研究SAK-HV促巨噬细胞增殖的结构基础。通过SAK-HV的三个功能域分别刺激RAW264.7细胞,结果表明SAK突变体是SAK-HV唯一有效地促进RAW264.7细胞增殖的功能域,且促增殖水平与SAK-HV相当;而野生型SAK则无此功能。结果证实SAK-HV通过SAK突变体功能域促发巨噬细胞增殖。激光共聚焦显微镜以及对RAW264.7细胞组分的Western b1ot检测分析显示SAK-HV可以进入RAW264.7胞浆,并少量入核。结合质谱分析和免疫共沉淀实验,我们筛选出Uba1是与SAK-HV具有直接相互作用的蛋白。同时激光共聚焦显微镜证实二者在RAW264.7胞内和核内存在共定位。基于对本研究数据的分析以及对大量已有研究的归纳,我们提出了一个SAK-HV介导的巨噬细胞增殖模型假说:SAK-HV通过阻断Uba1与特定E2-E3酶对的交互作用抑制了它们对特定靶标通路的泛素化修饰,促进巨噬细胞增殖效应。通过在RAW264.7细胞和原代巨噬细胞中的Uba1抑制,我们证实了 Uba1在SAK-HV触发的巨噬细胞增殖效应中的关键作用。该结果有力地支持了我们提出的模型假说。在该模型的指引下,我们筛查发现伴随总泛素化水平的升高,SAK-HV处理显著抑制了 MEKK1泛素化水平。有研究表明,MEKK1自泛素化可以抑制其激酶活性,从而降低JNK和ERK MAPK通路磷酸化水平。结果表明SAK-HV通过抑制MEKK1泛素化水平激活下游JNK和ERK MAPK通路,促进巨噬细胞增殖效应。综上所述,第二部分研究表明SAK-HV通过其SAK突变体功能域增强巨噬细胞增殖效应,其机制是通过和MEKK1的自泛素化来激活JNK和ERK MAPK通路促巨噬细胞增殖;我们还提出基于Uba1的巨噬细胞增殖模型假说:SAK-HV与E1酶Uba1的相互作用,可能阻断了 Uba1与特定E2酶的交互,从而触发上述途径促进巨噬细胞增殖。尽管SAK-HV促巨噬细胞增殖效应在其降脂和治疗AS过程中发挥的作用尚需进一步的研究,巨噬细胞增殖在生理、病理中发挥的关键作用使得对其机制的研究具有广泛的潜在临床转化应用前景。本文提出的SAK-HV促巨噬细胞增殖新机制,以及基于独特的Uba1水平泛素化调控的巨噬细胞增殖机制模型假说,为巨噬细胞增殖以及泛素化领域的研究提供了新的线索。
[Abstract]:A novel recombinant fusion protein , SAK - HV . SAK - HV , which is composed of SAK mutant , RGD sequence and C - terminal 12 peptide , has been studied in this study . The results showed that SAK - HV treated RAW264.7 cells and stimulated the proliferation of macrophages and vascular endothelial cells . In this paper , the new mechanism of SAK - HV stimulation for macrophage proliferation and the macrophage proliferation mechanism model based on the unique Uba1 level ubiquitination regulation are presented , which provides a new clue for the study of macrophage proliferation and ubiquitination .
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R589.2;R575.5
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本文编号：1917786