HIV-1单克隆中和抗体Y498的抗病毒活性和机制研究

发布时间：2018-05-28 16:01

本文选题：HIV-1 + 人源单克隆抗体　；参考：《北京协和医学院》2015年博士论文

【摘要】：为实现预防、治疗和治愈艾滋病的目标,近二十年来基于HIV-1中和抗体的研究成为热点。这些HIV中和抗体为通过技术手段在艾滋病感染者血液中分离、鉴定和改造的具有广谱中和活性的抗体,HIV中和抗体在疫苗设计和免疫治疗艾滋病感染者中发挥重要作用。目前为止,中国已发现了A、B'、B、C、CRF_D2(CRF07_BC/CRF08_BC)、 CRF01_AE、CRF02_AG7种亚型的HIV病毒,其中HIVB/C、A/E重组亚型毒株已成为中国主要的流行毒株。本论文以中国流行株B/C亚型病人为研究对象,在前期筛选到Y498Fab抗体的基础上,进一步对该抗体的抗病毒活性和机制进行了研究。在前期大规模筛选人源单克隆抗体的基础上,我们首先表达纯化了Y498Fab形式的抗体,通过活性检测实验证实抗体Y498Fab具有交叉反应活性和中和活性,之后成功构建了全分子Y498 (Y498IgG)抗体,进行活性检测,发现Y498对HIV-1 B、C、B/C多种亚型抗原具有交叉反应活性,同样对指示毒株NL4-3和SF162具有中和活性,SPR实验证实了Y498抗体与JRFL抗原有着非常强的亲和力,KD值为0.86nM,均高于b12(1.11nM)和VRC01 (5.35nM);与CN54抗原同样有着非常强的亲和力,KD值为0.46nM,均高于b12(13.28nM)和VRC01 (25.29nM)。而针对被检测的八个亚型81株假病毒中,Y498能够有效中和高达26%(21/81)的假病毒株,在81株假病毒中,有43株中国株,Y498能够中和其中的12株,占28%,而在所有被检测的B/C亚型中国株中,Y498的中和能力达到32%,且Y498对部分假病毒株中和能力强于b12和VRC01。提示该抗体具有一定的广谱中和活性。我们进一步对Y498的抗病毒机制做了研究。实验证实了Y498抗体与b12抗体一样,识别HIV-1包膜刺突上gp120的构象表位,随后的竞争实验发现其识别gp120上的CD4结合区,并与b12和VRC01竞争结合。生物信息学分析预测Y498抗体所识别的表位,联合筛选噬菌体随机展示文库技术发现,两者共有15个氨基酸位点重叠,我们以噬菌体12肽随机展示文库筛选到的6条肽段为基础,利用Pepitope service软件对Y498所识别的表位进行预测,共得到24个可能的表位氨基酸残基,对这些位点进一步定点突变进行活性检测,发现有4个重要的氨基酸位点影响了Y498抗体的结合活性,分别为F277, D279, D368, E370,该4个位点均位于gp120的CD4结合区内,随后的针对突变株中和实验发现,有2个氨基酸位点影响了该抗体的中和能力,分别为D368,E370,并且它们同时影响了Y498抗体的结合活性和中和活性,据此认为D368和E370为Y498抗体识别表位的关键位点。将这些Y498抗体表位相关的氨基酸位点与VRC01和b12相比较,发现D279为VRC01的关键位点,D368和E370为b12的关键位点,该结果与Y498分别竞争VRC01和b12相吻合。少数情况下,突变导致了中和活性的提高,推测主要由于单个氨基酸突变不足以破坏高亲和力抗体结合配体,这种情况同时印证了VRC01的类似中和机制。结合CD4在gp120上的结合位点分布,利用PyMOL软件将Y498抗体所识别的表位氨基酸进行展示,发现该四个位点位于CD4结合区的loop D区(F277, D279), CD4 binding Loop区(D368,E370)。综合针对Y498的抗病毒活性和机制研究,我们得出结论：Y498抗体对HIV-1不同亚型抗原均有较强的交叉反应活性和高的亲和力,同时对不同亚型的部分病毒毒株具有较为广谱的中和能力；Y498主要识别CD4结合区的CD4 binding loop,通过阻断受体结合的作用机制来阻止HIV的入侵;表位鉴定发现F277, D279, D368和E370为该抗体识别表位的关键氨基酸。Y498抗体的抗病毒活性和机制研究对了解HIV感染的中和抗体免疫应答分子机制,艾滋病疫苗设计以及免疫治疗和预防等具有一定的科学意义和应用价值。
[Abstract]:In order to achieve the goal of prevention , treatment and cure of AIDS , HIV - 1 neutralizing antibodies have become hot spots in recent 20 years . These HIV neutralizing antibodies have played an important role in the isolation , identification and modification of HIV - 1 neutralizing antibodies by technical means . So far , China has found A , B The anti - virus activity and activity of Y498Fab were studied . The results showed that Y498 had a strong affinity to the anti - HIV - 1 B , C and B / C subtypes . Four important amino acid sites were found to be the key sites of Y498 antibody recognition epitopes . The results showed that D368 and E370 were the key sites of antibody recognition .
Y498 mainly recognizes the CD4 binding loop of CD4 binding region , prevents the invasion of HIV by blocking the binding mechanism of the receptor , and finds that F277 , D279 , D368 and E370 are the key amino acids of the epitope of the antibody . The antiviral activity and mechanism of Y498 antibody have certain scientific significance and application value in understanding the mechanism of neutralizing antibody immune response in HIV infection , the design of AIDS vaccine and immunotherapy and prevention .
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.91

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