Exendin-4对体外培养的人视网膜色素上皮细胞（HRPE）的氧化应激水平以及PEDF、VEGF分泌的影响

发布时间：2018-06-06 11:25

本文选题：氧化应激 + E4　；参考：《西南医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由各种代谢紊乱的引起的综合征,认为是遗产原因和环境原因的彼此作用而引起的。迄今为止,我们认为,糖尿病的慢性并发症可由多种因素引起,但是常被人们所接收的4条途径为:即氨基己糖途径、多元醇通路激活、晚期的糖基化终末产物(advanced glycationend products,AGEs)增加、蛋白激酶C的(protein kinase C,PKC)激活,这些途径的本质都是高糖引起的氧化应激的产物过分表达的成果,故糖尿病并发症发生、发展的重要因素是氧化应激[1]。处于高糖应激状态下的机体,清除氧自由基的能力下降,氧自由基堆积,氧化系统与抗氧化防御系统的失衡,损伤了组织和细胞。视网膜富含多不饱和脂肪酸,具有高度摄取氧和氧化葡萄糖的能力,而RPE细胞处于脉络膜毛细血管层与光感受器细胞层之间的高氧环境,对于缺氧及氧化应激更为敏感。DM引起的糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是目前为止致盲率极高的,最严重的眼部并发症[2]。多种病理机制参与DR的形成。DR的新生血管及其纤维蛋白的生成、血-视网膜屏障破坏是其基本病理变化。新生血管的产生是临床治疗该病的关键环节,疾病的后面阶段所引起玻璃体内积血和由于粘连而拉扯而发生的视网膜剥离,严重影响视力,疾病发展严重时,可导致失明。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)分别作为主要的血管抑制因子与血管刺激因子,这两者之间的平衡性调节对于新生血管的生成是相当重要的。有研究表示,升高的血糖可以打破视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞中的VEGF和PEDF之间的动态平衡,使VEGF异常增多,从而引起RPE细胞的病理性增生。DR的发生发展需要多个因素的参与,DR的重要的病理环节即血-视网膜屏障功能破坏及视网膜病理性血管生成,认为高糖打破的VEGF和PEDF之间的动态平衡时诱导前两个重要的病理环节的直接诱导因素。Dong等专家认为VEGF过度分泌被过度的氧化反应所刺激,从而引起了视网膜的病理性血管的生成,因此,故在DM引起的DR中抗氧化剂,是具有临床意义的[3]。研究证明了胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)及其相类似物能够抵抗氧化应激过分反应、改善动脉粥样硬化,改善血管内皮的功能,具有降低心血管事件风险的潜在益处,这些研究提示胰高血糖素样肽-1保护RPE的作用可能与抗氧化抗炎作用有关。Exendin-4(E4)是一种毒蜥蜴的唾液中分离出的一种天然GLP-1类似物,与哺乳动物的GLP-1具有较高的同源性。E4具有促进胰腺胰岛素的生成、增加其敏感度、改善胰岛细胞的正常生理作用,且不被二肽基肽酶IV(Dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV)分解,血浆半衰期较长,故此药物运用在临床对糖尿病治疗,是具有稳定性和长效性的[4]。故本实验应用不同浓度的E4作用于在高糖环境下,体外培养的人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelial,HRPE)细胞株ARPE-19 48h,并且观察细胞的活力、细胞的形态、氧化应激指标及其PEDF、VEGF分泌的影响。方法:ARPE-19细胞株,在人体外培养48h,并随机的分成5个实验组:(1)、正常参照组(葡萄糖浓度为:5mmol/l);(2)、高糖组(葡萄糖浓度为:25mmol/L);(3)、高糖+E4(12nmol/L)组;(4)、高糖+E4(60nmol/L)组;(5)、高糖+E4(120nmol/L)组。各组细胞在CO2水平(5%)、温度(37°C)的细胞培养箱中,应用上述不同条件的培养液在细胞培养箱中培养48h,选取处于处于对数生长期的细胞来做相关实验。观察HRPE细胞活力和形态,比色法检测总超氧化物歧化酶(total-superoxide dismutase,T-SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的变化,HRPE细胞的上清液中PEDF与VEGF的含量用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法来测定,研究在高糖环境下,Ex-4对HRPE细胞的保护机制,从而更进一步研究此药物对治疗DR的作用机制。结果:1.对比正常参照组,高糖组的GSH含量、总-SOD的活性显著下滑,然而MDA的含量显著提高(P0.05);E4(12,60,120nmol/L)作用后,与高糖组对比,各给药组GSH含量及总-SOD活性都有相应的提高,而MDA含量均下滑(P0.05),并且有浓度依赖性。2.对比正常参照组,高糖组PEDF分泌含量显著下滑,VEGF分泌含量显著提高(P0.05);E4(12,60,120nmol/L)作用后,与高糖组对比,各给药组的PEDF的分泌量提高,同时降低VEGF的分泌量,具有统计学差异(P0.05),并且有浓度依赖性。结论:1.在高糖环境的作用下,将增强HRPE氧化应激的水平,同时使血管刺激因子与血管抑制因子之间的调节失衡,造成PEDF分泌量的下滑,然后VEGF分泌量的增多,我们认为,这很大程度上是与DR的发生发展进程有关。2.一定浓度的E4Ex-4可降低在高糖环境下作用的HRPE细胞的氧化应激指标,PEDF分泌增多和VEGF分泌减少。这就提示了E4可能的作用机制,即通过对氧化作用和抗氧化作用之间的调节,进而调节PEDF和VEGF的平衡,从而使HRPE细胞得以保护,抑制了DR病理性血管的形成,阻止了血-视网膜屏障被破坏。即DR的两个的重要的病理环节即DR的病理性血管的生成和血-视网膜屏障功能的破坏都被阻断,这就延缓和阻断了DR的进程。因此猜想可以运用到预防DR和治疗DR。但对E4应用于临床用于预防DR的发生发展仍然需要大量的临床随机对照试验。
[Abstract]:Objective : Diabetes mellitus ( DM ) is a syndrome caused by various metabolic disorders . It is considered that the cause of diabetes mellitus and the causes of environment are interrelated to each other . So far , we believe that the chronic complication of diabetes can be caused by various factors . So far , the four routes received by people are : aminocaproic acid pathway , polyol pathway activation , advanced glycationend products ( AGE ) increase , protein kinase C ( PKC ) activation , the essence of these pathways is the result of excessive expression of oxidative stress caused by high sugar , so the important factor of development of diabetes complication is oxidative stress . The imbalance of oxygen free radical scavenging ability , oxygen free radical accumulation , oxidation system and anti - oxidation defense system in high sugar stress state has damaged tissues and cells . The retina is rich in polyunsaturated fatty acids , which has the ability to take oxygen and oxidize glucose , while RPE cells are more sensitive to hypoxia and oxidative stress . Diabetic retinopathy ( DR ) caused by DM is the most common and most serious complication of ocular complications . It is important for the development and development of DR to break the dynamic balance between VEGF and PEDF in retinal pigment epithelial ( RPE ) cells . The study shows that glucagon - like peptide - 1 ( GLP - 1 ) and its analogs can resist over - reaction of oxidative stress , improve atherosclerosis , improve the function of vascular endothelium , and have the potential benefits of reducing the risk of cardiovascular events . These studies suggest that glucagon - like peptide - 1 protects RPE . It has high homology with GLP - 1 in mammals . The effects of different concentrations of E4 on human retinal pigment epithelial cells ( HRPE ) cells cultured in vitro under high sugar environment were studied . The effects of cell viability , cell morphology , oxidative stress index and PEDF and VEGF secretion were observed . Results : 1 . Compared with the high sugar group , the content of GSH and the activity of total - SOD decreased significantly after the action of high sugar environment .
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2;R774.1

【参考文献】