自噬在糖皮质激素调控成骨细胞功能中的作用和机制

发布时间：2018-06-21 23:42

本文选题：细胞自噬 + 糖皮质激素　；参考：《中国人民解放军医学院》2015年硕士论文

【摘要】：目的通过从细胞自噬角度探讨糖皮质激素对成骨细胞的调控,即糖皮质激素是否引起成骨细胞自噬,自噬流的强弱是否与糖皮质激素剂量及作用时间有关,以及人为干预自噬是否对当皮质激素作用下的成骨细胞功能产生影响,进一步拓展了激素相关骨质疏松的病理机制,对阐明自噬是否参与了糖皮质激素诱导的骨质疏松(GIOP),以及为发现抗骨质流失药物新靶点提供了重要参考价值。方法首先将培养的小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1等量接种于六孔板中,待培养一段时间后,分别加入含有不同浓度地塞米松的培养基(10-8M,10-6M,10-4M),分别在1d,2d,3d,4d时间点收集细胞。①通过Western blot技术检测成骨细胞内源性自噬相关蛋白LC3及Beclin1的表达量,探讨地塞米松是否诱导了细胞自噬以及自噬水平是否与激素剂量和作用时间有关。②使用能表达绿色荧光蛋白GFP的LC3B质粒转染细胞,然后再与含有不同浓度地塞米松的培养液共同作用,通过荧光共聚焦显微镜检测细胞质内是否有特征性的GFP-LC3B聚集,即直视下观察是否有自噬小体的形成以及自噬小体阳性细胞的数量。③应用流式细胞仪检测地塞米松作用下成骨细胞的凋亡情况,以及人工干预自噬是否可以调控成骨细胞凋亡。④最后,应用荧光定量PCR技术检测地塞米松作用下,功能基因的表达情况,以及加入自噬诱导剂雷帕霉素、自噬抑制剂3-MA后,成骨细胞功能基因表达是否发生变化。结果1.蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测显示地塞米松诱导下,MC3T3-E1细胞中有LC3-Ⅱ、Beclinl蛋白的表达；荧光共聚焦显微镜显示细胞质内有GFP-LC3B斑点产生。2.随着培养液中地塞米松浓度的升高,Western blot检测成骨细胞内源性自噬相关蛋白LC3B及Beclinl表达均呈上升趋势。荧光共聚焦显微镜检测eGFP-LC3B标记的自噬小体。培养液中药物浓度上升时,eGFP-LC3B斑点数量上升、更加浓聚,eGFP-LC3B阳性细胞数量增多。3.随着Dex作用时间延长,细胞中自噬相关蛋白LC3B及Beclinl的表达在48小时达到峰值,随后下降。镜下观察eGFP-LC3B阳性细胞数量以及荧光斑点形成情况也与Western blot检测蛋白表达情况相符。4.随着地塞米松浓度升高,MC3T3-E1细胞凋亡率增加；加入自噬抑制剂3.MA后,细胞凋亡率上升。5.随着地塞米松浓度升高,MC3T3-E1细胞Alp、Colla、Ocn基因的表达量下降。加入自噬抑制剂3-MA后,基因表达量进一步降低,加入自噬诱导剂雷帕霉素后,基因表达量下降不明显。结论：1.糖皮质激素GCs可以诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1的自噬发生2.细胞中自噬水平与地塞米松作用浓度呈正相关；自噬水平在地塞米松作用48h达到峰值,而后随着时间延长而下降3.地塞米松诱导小鼠成骨细胞的凋亡,且浓度增加凋亡率增高。抑制自噬可以促进细胞的凋亡。4.地塞米松抑制小鼠成骨细胞基因的表达,抑制作用随浓度增加而增加。提高自噬可以保持基因的表达不受影响,抑制自噬可以进一步抑制基因的表达。
[Abstract]:Objective To investigate the effect of glucocorticoid on osteoblast in vitro by means of Western blot . ( 2 ) The expression of endogenous autophagy - related protein LC3 and Beclin1 was detected by Western blot .
3 . The number of eGFP - LC3B - positive cells increased and the expression of eGFP - LC3B - positive cells increased . The number of eGFP - LC3B - positive cells and the formation of fluorescent spots increased with the increase of dexamethasone concentration .
The apoptosis rate of MC3T3 - E1 cells decreased with the increase of dexamethasone concentration . After addition of autophagy inhibitor 3 - MA , the expression of MC3T3 - E1 cells decreased further , and the expression level of MC3T3 - E1 decreased . Conclusion : 1 . Glucocorticotropin - GCs can induce autophagy of MC3T3 - E1 in mouse osteoblasts .
The autophagy inhibited the apoptosis of osteoblasts in mice after 48 hours of dexamethasone , and then decreased with time .
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R580

【共引文献】