TNF-α通过上调P2Y2受体表达抑制骨形成在绝经后骨质疏松中的作用及机制研究

发布时间：2018-06-28 12:15

本文选题：雌激素 + 骨质疏松　；参考：《第二军医大学》2017年硕士论文

【摘要】：背景:骨质疏松症是最常见的代谢性骨病,其特征是骨结构改变,包括骨量减少和骨微结构破坏。众所周知,雌激素是维持正常骨量的重要保护因子,绝经后妇女雌激素水平降低导致骨质流失,引起骨质疏松(osteoporosis,OP)及骨折风险增大。女性绝经后肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量明显增加,它能够抑制骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞分化,从而抑制骨形成,但TNF-α抑制骨形成的确切机制尚未完全阐释。现知,嘌呤系统P2受体能够调节细胞生长,细胞迁移,并参与调节多种组织细胞分化,且能够调节骨代谢。但目前尚不清楚,P2受体是否参与了TNF-α抑制骨形成的过程。目的:1.明确在TNF-α抑制MSCs向成骨分化过程中P2受体表达量的改变;2.确定P2受体在TNF-α抑制MSCs的成骨分化中的作用;方法:1、体外培养骨髓间充质干细胞,采用TNF-α(10 ng/ml)干预,成骨诱导第7天后qRT-PCR检测嘌呤受体家族不同受体及亚型的表达;2.采用去卵巢手术构建绝经后骨质疏松小鼠模型,将30只C57小鼠随机分为三组:10只行去卵巢手术(去卵巢手术组,即OVX组),10只行去卵巢手术加尾静脉注射TNF-α中和抗体(去卵巢+TNF-α中和抗体组,即OVX+anti-TNF-α组),10只行假手术(假手术组,即Sham组)。利用Micro-CT、四环素双标、石蜡包埋切片、硬组织切片、HE染色、免疫组化等方法评价骨超微结构及骨代谢相关基因的变化;3.ELISA测定各组小鼠血液中TNF-α水平;4.实时荧光定量PCR、Western blot测定目的蛋白水平;碱性磷酸酶活性测定、碱性磷酸酶染色、茜素红染色评价成骨能力。5.通过CRISPR/Cas9敲除质粒及CRISPR激活质粒转染,分别观察P2Y2受体抑制/过表达时对TNF-α抑制MSCs成骨分化的影响。结果:1.体外分离骨髓间充质干细胞,在成骨诱导培养基中给予10 ng/ml的TNF-α并培养,7天后P2Y2受体表达显著上调。2.三组小鼠饲养8周后,分离股骨行Micro-CT扫描结果,显示去卵巢小鼠BV/TV、Tb.Th、Tb.N值均低于假手术组和去卵巢+TNF-α中和抗体组,且差异均有统计学意义。OVX+TNF-α中和抗体组小鼠骨小梁结构明显改善。ELISA测定小鼠血清TNF-α水平,显示去卵巢组小鼠TNF-α水平显著高于假手术组和去卵巢+TNF-α中和抗体组。免疫组织化学分析表明:去卵巢+TNF-α中和抗体组小鼠骨组织中P2Y2受体表达水平显著低于去卵巢组小鼠。获取三组小鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养,qRT-PCR及western blot结果提示:P2Y2受体在去卵巢+TNF-α中和抗体组中表达水平显著低于去卵巢组。3.在培养的骨髓间充质干细胞中,与对照组相比,P2Y2 CRISPR/Cas9敲除质粒转染后成骨特异性相关基因Runx2、Osterix和Osteocalcin表达水平显著上调,碱性磷酸酶活性显著增强,且钙结节沉积数量显著增加;相反,P2Y2 CRISPR过表达质粒转染后Runx2、Osterix和Osteocalcin基因表达显著下调,碱性磷酸酶活性显著降低,钙结节沉积数量显著减少。TNF-α干预骨髓间充质干细胞可显著下调Runx2、Osterix和Osteocalcin基因表达、降低碱性磷酸酶活性、且明显减少钙结节沉积数量。给予P2Y2 CRISPR/Cas9敲除质粒转染后,TNF-α对上述成骨相关指标的抑制作用均被显著逆转。结论:本研究发现去卵巢骨质疏松小鼠的血清中TNF-α表达水平显著上调,且骨组织中P2Y2受体表达增加,给予TNF-α抗体干预后可显著逆转去卵巢小鼠骨质疏松严重程度,且同时伴随P2Y2受体表达下调,说明在去卵巢引起骨质疏松症中,P2Y2受体可能参与TNF-α对成骨的抑制作用。体外骨髓间充质干细胞培养发现,TNF-α可显著上调P2Y2受体表达,并下调成骨相关基因的表达,而P2Y2基因敲除后可显著逆转TNF-α对成骨相关基因的抑制作用,进一步证明P2Y2受体参与TNF-α的成骨抑制作用。这些结果提示,在雌激素水平下降引起的骨质疏松症中,可能是通过上调P2Y2受体,进一步强化TNF-α对成骨作用的抑制来完成的。
[Abstract]:BACKGROUND : Osteoporosis is the most common metabolic bone disease . It is characterized by changes of bone structure , including osteopenia and destruction of bone microstructure . It is well known that estrogen is an important protective factor to maintain normal bone mass . The results showed that the expression of P2Y2 receptor in bone marrow mesenchymal stem cells was significantly lower than that in sham - operated group and ovariectomized + TNF - 伪 . In vitro bone marrow mesenchymal stem cell culture showed that the expression of P2Y2 receptor could significantly increase the expression of the P2Y2 receptor and down - regulate the expression of TNF - 伪 . These results suggest that the P2Y2 receptor is involved in the formation of bone - related genes . These results suggest that the P2Y2 receptor may be involved in the inhibition of bone formation by up - regulating the P2Y2 receptor .
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R580

【参考文献】