双膦酸盐结合BMSCs治疗椎体骨质疏松的实验研究

发布时间：2018-07-07 18:38

本文选题：骨髓间充质干细胞 + 移植　；参考：《山西医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定和标记目的:通过体外分离、培养、扩增、诱导BMSCs,研究BMSCs的生物学特性和形态学特征。用荧光标记BMSCs,通过描绘、对比其生长曲线来比较荧光染料对BMSCs细胞活性的影响。方法:1.无菌条件下取大鼠的股骨和胫骨,用全骨髓贴壁培养法分离、纯化BMSCs。待细胞铺满瓶底90%左右,1:2进行传代。2.用流式细胞仪检测贴壁细胞表面抗原,鉴定是否为目的细胞。3.选取生长状态良好的P3代细胞,成骨诱导21天,行茜素红和von Kossa改良染色法,观察其产生钙结节能力。4.用CM-Dil标记BMSCs,观察其标记能力。通过计数和对比非标记细胞的数目,并绘制生长曲线,明确CM-Dil对BMSCs增殖能力影响。结果:1.SD大鼠骨髓细胞全贴壁培养24h后部分贴壁,呈大小不能的球形;48h后大部分细胞贴壁,呈纺锤形或星形;6-7d后可以进行首次传代。2.所培养的贴壁细胞99%以上表达CD29,CD44和CD90,不表达CD34,CD45。证明所培养的细胞为BMSCs。3.茜素红染色可见矿化结节呈红色,Von Kossa改良染色法光镜下可见被染成红色的细胞团块中间有粗大的黑色结节。证明间充质干细胞确实被诱导成了成骨细胞并且有钙结节产生。4.CM-Dil对BMSCs的即时标记率为100%,通过观察、计数、对比其细胞形态和细胞数目,发现并无明显差别。结论:1.全骨髓贴壁培养法能获得理想的BMSCs。2.BMSCs经诱导后有产生钙结节的能力。3.CM-Dil能够有效的标记BMSCs,且不会影响其生物学性质,是体外示踪的有效方法。第二部分大鼠骨质疏松模型的建立目的:有效建立大鼠椎体骨质疏松模型并鉴定是否骨质疏松。方法:1.雌性大鼠双侧卵巢切除术。2.通过观察大鼠阴道分泌物涂片,确认是否切除卵巢成功。结果:切除卵巢的大鼠不再有性动周期,连续一周的阴道分泌物涂片均停留在动情间期。结论:1.通过去除大鼠双侧卵巢建立骨质疏松模型的方法是可行的。2.通过连续观察大鼠阴道分泌物涂片能够判断大鼠去势成功。第三部分骨髓间充质干细胞联合双膦酸盐治疗骨质疏松椎体的实验研究目的:在前期建立椎体骨质疏松模型基础上,给予大鼠相应椎体移植不同浓度BMSCs以及双膦酸盐治疗,通过测量相关指标,判断其疗效。方法:1.12周龄未交配过的雌性大鼠100只,随机分为5组,每组20只。①对照组;②去势组;③去势+移植组;④去势+双膦酸盐组;⑤去势+移植+双膦酸盐组。2.采用切除双侧卵巢的方法构建骨质疏松模型。去势12周后,将CM-Dil标记的 P3代BMSCs,用 1ml 注射器以5×104/ml、5×105/ml、5×106/ml、5×107/ml、5×108/ml浓度的细胞悬液等体积分别注入③组和⑤组大鼠L2-L6的椎体,L1椎体注入等体积的荧光悬液。④组和⑤组大鼠给予阿仑膦酸钠灌胃处理(8.2mg/kg),每周一次,连续12周。所有大鼠均在同一条件下喂养。3.治疗后12w分别处死相应组大鼠20只。4.通过硬组织磨片机制作骨磨片,荧光显微镜观察干细胞是否移植成功。5.通过MicroCT测量相关的骨代谢指标,判断是否有疗效。结果:1.移植干细胞后12w制作骨组织磨片,荧光显微镜下观察,能观察到新生骨小梁中有红色荧光发出。2.将切除双侧卵巢的大鼠于12w后分别通过Micro-CT检测,发现②组大鼠相比于①组大鼠其椎体BMD,Tb.N,Tb.Th,BV/TV是显著下降的。BMD降低了37.86%(P0.05);Tb.N 降低了 77.25%(P0.05);Tb.Th 降低了 43.48%(P0.05);BV/TV 降低了 66.67%(P0.05)。3.Micro-CT检测发现,④组和②组相比,ALE治疗能明显改善大鼠椎体松质骨的骨微结构,BMD升高了 16.19%(P0.05);Tb.N升高了 49.61%(P0.05);Tb.Th 升高了 57.69%(P0.05);BV/TV 升高了 55.56%(P0.05)。4.Micro-CT检测发现,③组大鼠L1与②组大鼠椎体骨微结构参数相差不大。随着BMSCs移植浓度的升高,L2-L6椎体呈现出BV/TV,Tb.Th,Tb.N,BMD逐渐增加,BS/BV,Tb.Sp逐渐降低的趋势。。5.Micro-CT检测发现,⑤组和③组相比,L2-L6椎体骨密度均升高,L1椎体骨密度与④组骨密度接近,⑤组和①组相比,L6椎体骨密度接近,但前者依然低于后者。结论:1.荧光标记的干细胞椎体移植成功。2.通过摘除大鼠双侧卵巢可成功建立骨质疏松模型,随着时间延长,去势大鼠的骨质愈加疏松。3.阿仑膦酸钠能够减缓骨质疏松的进展。4.干细胞能够改善骨量,增加骨密度,但是12w内并不能增加到正常椎体水平。随着移植干细胞数量的增加,椎体骨密度是增加的,并没有实验出最佳的移植浓度。5.阿仑膦酸钠联合干细胞移植改善骨质疏松的效果优于单独运用干细胞移植和单独运用阿仑膦酸钠的效果,但是依然达不到正常骨质水平。
[Abstract]:In vitro isolation , culture , identification and labeling of bone marrow mesenchymal stem cells in rats were studied . The results were as follows : 1 . After 12 weeks of treatment , 100 rats with different concentrations of bone marrow mesenchymal stem cells were injected into 3 groups and 5 脳 105 / ml , 5 脳 106 / ml , 5 脳 107 / ml , 5 脳 108 / ml . Conclusion : 1 . The bone mineral density of L2 - L6 vertebral body is increased with the increase of bone mineral density .
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R580

【参考文献】