蜂毒素联合杜仲黄酮治疗类风湿关节炎的实验研究

发布时间：2018-07-09 19:28

  本文选题：关节炎 + 类风湿　； 参考：《扬州大学》2017年硕士论文

【摘要】：引言类风湿关节炎(Rheumatoid Arthrits,RA)是主要累及小关节的滑膜慢性炎症,属于自身免疫性疾病范畴,常常会引起关节肿痛、软骨破坏、关节间隙变窄、关节畸形等改变,若得不到及时和正确的诊治会造成人体不同程度的残疾[1]。该病属于传统医学的痹症范畴,常见症型有4种:风寒湿痹、风湿热痹、痰瘀痹阻、肝肾阴虚等。RA患者骨与关节的早期病理变化是骨质疏松(Osteoporosis,OP),有研究指出RA患者普遍存在骨量流失的现象。Wnt信号通路在炎症与骨代谢方面发挥重要作用,主要通过Wnt家族蛋白或信号通路上相关蛋白通过自分泌或旁分泌的方式与细胞膜上相应受体结合,激活细胞质中的对应信号分子,从而促进下游基因转录。蜂毒素(Melittin),是蜂毒中具有药物作用的主要活性物质,具有抗炎、抗菌与镇痛药用价值。有研究表明蜂毒素能够有效抑制多种病原微生物生长。蜂针、蜂疗已有千年历史,尤其是在治疗关节炎等炎性疼痛方面,疗效显著。但蜂毒素存在易溶血和易过敏的不良反应,限制其应用范围。杜仲(EucommiaulmoidesOliver)为落叶乔木,《神农本草经》记载杜仲“主治腰膝痛,补中,益精气,坚筋骨,除阴下痒湿,小便余沥。久服,轻身耐老”的作用。杜仲是中国特有药材,广泛应用于临床,其性甘,温。归肝、肾经。现代药理研究发现:杜仲对中枢神经、循环、免疫、内分泌、泌尿系统均存在不同程度的调节作用。有大量研究表明杜仲提取物在体外有较显著的抗氧化溶血而保护红细胞的作用。杜仲黄酮是杜仲的有效提取物。蜂毒素具有易溶血的不良反应,而杜仲具有明显的抗溶血作用,故将二者联合使用观察杜仲能否减轻蜂毒素的溶血作用,进而增加抗炎作用。本文从细胞、分子、动物层面探究蜂毒素、杜仲黄酮单用及联合给药的最佳药物浓度及治疗效果。研究发现CIA模型小鼠关节会出现骨量不均的现象,与人类RA的早期病理改变——骨质疏松相似,中医强调关节乃骨之连接,筋脉聚集之所,肝主筋、肾主骨,本文在动物实验的基础上进行了肝肾阴虚型类风湿关节炎临床发病情况及与骨质疏松的关联的探讨。本论文共分为三部分研究内容。第一部分蜂毒素联合杜仲黄酮通过WNT信号通路抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞生长机制的研究目的:探究蜂毒素联合杜仲黄酮通过调节Wnt信号通路上Wnt-1,Dkk-1,C-myc,β-catenin蛋白抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的生长机制。方法:选择类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RA-FLS)培养至3-7代,流式细胞术检测细胞表面标记抗体,验证为RA-FLS细胞。待细胞增殖至适当数目后接种于六孔板中,除空白对照外其余各孔加入10ng/mLTNF-α诱导RA-FLS细胞成为异常增殖的类风湿关节炎细胞模型。用不同浓度的蜂毒素、杜仲黄酮、蜂毒素联合杜仲黄酮混合制剂处理RA-FLS细胞模型,MTT法检测细胞增殖情况。Western Blot检测不同处理组Wnt-1、β-catenin、C-myc及DKK-1蛋白的表达情况。所有实验结果运用SPSS19.0进行整理与分析。结果:浓度为1、10、100、1000ng/μL的蜂毒素、杜仲黄酮无论是单独还是联合使用均可以有效地减低RA-FLS的生存率。其中药物浓度为1000ng/μL蜂毒素联合杜仲黄酮对细胞抑制率最高,达到89.73%.用药后Wnt-1、β-catenin、C-myc、DKK-1蛋白的表达量均较TNF-a诱导的RA-FLS模型组明显降低,蜂毒素联合杜仲黄酮组的蛋白含量最低。(p0.05)结论:蜂毒素联合杜仲黄酮能够有效抑制被TNF-a诱导刺激异常增殖的RA-FLS的生长,药物浓度为1000ng/μL效果最好,作用机制可能是通过抑制Wnt信号通路Wntl、β-catenin、C-myc、DKK-1蛋白的表达。第二部分外用蜂毒素联合杜仲黄酮治疗胶原诱导型关节炎小鼠模型目的:观察外用蜂毒素联合杜仲黄酮治疗胶原诱导型关节炎小鼠模型的效果。方法:将昆明小鼠分为空白对照组与造模组,造模组按照胶原诱导型(CIA)小鼠造模方法制备成关节炎小鼠,分为PBS组、蜂毒素组、杜仲黄酮组及混合给药组。按分组不同,每组给予不同的药物(药物浓度均为1μg/μL)外涂。每只足爪给予5pL药物,共给药15天,PBS对照组给予等量的PBS。每日测量小鼠的足垫厚度及踝关节的宽度;给药前后均进行足爪部位X线检查;待给药结束后处死小鼠,ELISA法检测相关因子(TNF-α、IL-1β、IL-2、GM-CSF);计算关节肿胀度及脾指数。实验数据采用SPSS19.0统计处理。全结果:肉眼观察可见,蜂毒素、杜仲黄酮及混合给药组的小鼠足爪的肿胀程度均轻于造模PBS组;通过足垫厚度、足踝宽度及足爪肿胀度测量比较后发现,给药组小鼠的关节肿胀情况均得到缓解,其中混合给药组小鼠的关节改善情况优于其他组(p0.05);ELISA检测小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-2、GM-CSF等炎症因子发现,混合给药组小鼠各项免疫学指标改变优于其他组(p0.05)。结论:外涂蜂毒素、杜仲黄酮、蜂毒素联合杜仲黄酮均可以有效改善CIA小鼠的关节肿胀情况,其中混合给药组效果最好,具体的作用机制可能是抑制相关炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-2、GM-CSF)的表达。第三部分:肝肾阴虚型类风湿关节炎与骨质疏松相关性临床研究目的:探究肝肾阴虚型RA患者伴发骨质疏松的发生情况,并从类风湿关节炎相关指标、急性炎症指标、骨代谢指标、骨密度结果分析其相关性。方法:选择2015年10月～2016年5月来自上海光华中西医结合医院关节内科的类风湿关节炎住院病人。参与研究的患者应排除相关禁忌,参与本研究前未进行过正规抗骨质疏松治疗,且女性均为绝经后患者,男性年纪均超过50岁。完成相关调查表的填写,主要对其血常规、急性炎症指标(血沉ESR,C-反应蛋白CRP)、类风湿因子(IgMRF、IgARF、IgGRF)、抗环瓜氨酸肽抗体(抗CCP抗体)、骨代谢指标(骨钙素OT;Ⅰ型胶原交联C末端肽CTX;Ⅰ型胶原N端前肽PINP;甲状旁腺激素PTH;1,25(OH)2D3)检测数值、腰椎和左髋部进行常规骨密度(BMD)数值的填写。所有实验结果运用SPSS19.0进行整理与分析。结果:共64名RA患者参与研究,其中30人同时伴发骨质疏松(46.88%)。患者的血红蛋白值在骨量正常与骨量减少、骨量正常与骨质疏松组间存在统计学差异,骨量正常组的血红蛋白数值较高。抗CCP抗体、IgMRF与髋部BMD水平呈明显的负相关关系。年龄、抗CCP抗体滴度、ESR情况均为是否发生伴发骨质疏松的危险因素。年龄大于65岁患者较其他患者骨质疏松的风险多一倍;高滴度抗CCP抗体患者腰椎OP的发生情况比其他患者高13倍;高滴度抗CCP抗体患者髋部OP的发生情况其他患者的4倍余;血沉异常患者的腰椎及髋部OP的发生情况均较其他患者多9倍。结论:年龄大于65岁,抗CCP抗体和ESR水平较高、血红蛋白水平较低的肝肾阴虚型RA患者更易伴发骨质疏松。
[Abstract]:Rheumatoid arthritis ( RA ) is a kind of chronic inflammation of synovial membrane which is mainly involved in facet joint , and belongs to the category of autoimmune diseases . It often causes joint swelling and pain , cartilage destruction , joint gap narrowing , joint deformity and so on . In this paper , there are four kinds of diseases , such as wind - cold - dampness , rheumatalgia , phlegm - stasis , liver - kidney yin deficiency , etc . In this paper , we studied the expression of Wnt - 1 , 尾 - catenin , C - myc and DKK - 1 protein in RA - FLS cells . The results showed that the concentration of total flavonoids was 1 , 10 , 100 , 1000ng / 渭L , and the expression of Wnt - 1 , 尾 - catenin , C - myc and DKK - 1 protein in different treatment groups was significantly lower than that of TNF - a - induced RA - FLS . The results showed that the mice were divided into two groups : PBS group , TNF - 伪 , IL - 1尾 , IL - 2 and GM - CSF . Objective : To study the correlation between the levels of bone mineral density ( BMD ) in patients with liver and kidney yin deficiency type RA patients .
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R593.22
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本文编号：2110421