糖尿病肾病患者TGF-β1基因表达调控区甲基化水平变化及意义的研究

发布时间：2018-07-11 14:12

本文选题：糖尿病肾病 + 转化生长因子β1　；参考：《第三军医大学》2016年硕士论文

【摘要】：转化生长因子β(TGF-β)是一种分泌型多肽分子,属于TGF超家族。人类体内TGF-β有3种亚型TGF-β1、2、3,其中TGF-β1在细胞中含量最为丰富,是一种多功能细胞生长因子。在糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)发生过程中,肾小球系膜细胞表型转化是最为突出的早期表现,系膜细胞增殖、大量合成细胞外基质并异常聚积,由此导致的肾小球硬化是DN的主要病理特征,而TGF-β1活化是导致系膜细胞转化的关键。DNA甲基化作为重要的表观遗传修饰方式之一,在调节DN患者肾脏纤维化和DN相关基因表达方面起到至关重要的作用。既往研究提示关键基因启动子区的甲基化状态与转录活性有关,而导致DN患者肾纤维化的关键因子,TGF-β1启动子区DNA甲基化和DN之间的关系尚未见报道。本课题拟探讨糖尿病肾病患者TGF-β1基因表达调控区甲基化水平变化以及与血清TGF-β1含量之间的关系,先检测糖尿病肾病(DN)患者TGF-β1基因表达调控区DNA甲基化水平变化,同时观察TGF-β1蛋白水平、炎症因子及致纤维化因子水平、临床生化指标、糖尿病肾病患者肾小球病理改变情况,最后将TGF-β1基因表达调控区DNA甲基化水平变化与血清TGF-?1等相关指标进行相关分析。方法:选取2013年6月到2015年5月于第三军医大学第二附属医院住院的2型糖尿病患者(依据1999年WHO修订的糖尿病诊断及分型标准)101例[估计肾小球滤过率(e GFR)≥30毫升/分钟/1.73 m2],同时排除慢性肾炎、尿路感染、心力衰竭、原发性高血压等疾病。根据尿微量白蛋白/肌酐(UACR)比值分为单纯糖尿病组(DM组,UACR30μg/mg,n=42),糖尿病肾病组(DN组,30μg/mgUACR300μg/mg,n=49),氯沙坦治疗糖尿病肾病组(LOS组,30μg/mgUACR300μg/mg,n=20),所有入组DN患者行肾穿刺活检证实为糖尿病肾病。参照2010年Tervaet等提出的DN病理诊断及分型标准对DN组及LOS组患者病理变化进行分级。30名于我院同期体检健康志愿者作为对照组(Con组),均排除糖尿病和其他系统疾病。本临床研究获得第三军医大学新桥医院伦理委员会的批准,所有受试者均签署知情同意书。参数检测:抽提受试者外周血白细胞DNA,亚硫酸氢钠修饰处理DNA。MSP初筛各组TGF-β1基因表达调控区甲基化率,BSP检测TGF-β1基因表达调控区甲基化水平。检测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、空腹血糖(FBS)、餐后血糖(PBS)、糖化血红蛋白(Hb A1c)、血清TGF-β1、C反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、尿微量白蛋白/肌酐(UACR)、尿单核细胞趋化蛋白-1/肌酐(UMCR)、尿Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ),使用公式186.3×(Scr/88.4)-1.154×年龄-0.203[×0.742(若为女性)]计算e GFR。结果:1.MSP法初筛TGF-β1基因表达调控区DNA甲基化水平的变化,Con组甲基化率为73.3%,DM组下降为42.8%,DN组进一步下降为12.2%,组间比较均有显著性差异。LOS组甲基化率为20%,与DN组比较也有显著性差异。2.用BSP法进一步检测TGF-β1基因表达调控区DNA甲基化水平的变化,发现Con组甲基化水平为66.7±9.1%,DM组为35.6±6.0%,DN组为12.5±8.1%,三组间均有显著性差异。LOS组为18.7±6.2%,比DN组甲基化水平有显著升高。3.ELISA检测血清TGF-β1含量变化,Con组为296.38±74.37 ng/L,DM组为1367.22±126.13 ng/L,DN组为2885.73±411.36 ng/L,三组间有显著性差异。LOS组血清TGFβ1含量为1523.82±173.71 ng/L,与DN组比较有显著减少(P0.01)。4.血清中炎症细胞因子检测发现,C反应蛋白(CRP),Con组为6.53±0.25 mg/L,DM组为11.15±0.83 mg/L,DN组为19.03±2.57 mg/L,LOS组为12.84±1.62 mg/L;白细胞介素-6(IL-6),Con组为2.69±0.15 ng/L,DM组为5.02±0.19 ng/L,DN组为7.47±1.09 ng/L,LOS组为5.41±0.51 ng/L;白细胞介素-8(IL-8),Con组为54.84±2.36 ng/L,DM组为147.68±5.70 ng/L,DN组为289.09±30.79 ng/L,LOS组为160.13±14.61 ng/L;肿瘤坏死因子?(TNF?),Con组为7.57±0.75 ng/L,DM组为15.83±0.63 ng/L,DN组为45.57±7.68 ng/L,LOS组为22.64±7.61 ng/L。这些指标在Con组、DM组、DN组三组间均有显著差异,LOS组显著低于DN组。5.尿液分析发现,尿IV型胶原(Col-Ⅳ),Con组为39.59±12.56 pg/ng,DM组为151.40±20.62 pg/ng,DN组为374.16±81.09 pg/ng,LOS组为170.63±13.43 pg/ng;尿单核细胞趋化细胞蛋白-1/肌酐比值(UMCR),Con组为7.73±0.45μg/L,DM组为37.14±9.03μg/L,DN组为93.59±27.68μg/L,LOS组为50.76±10.46μg/L。这些指标在Con组、DM组、DN组三组间均有显著差异,LOS组显著低于DN组。6.Pearson相关分析得出血清TGF-β1水平与FBS(r=0.942)、PBS(r=0.682)、BUN(r=0.479)、Scr(r=0.756)、CRP(r=0.731)、IL-6(r=0.653)、IL-8(r=0.675)、TNF?(r=0.729)、UACR(r=0.718)、UMCR(r=0.794)、Col-Ⅳ(r=0.746)呈正相关(均P0.01),与e GFR(r=-0.805)和TGF-β1基因调控区甲基化水平(r=-0.925)呈负相关(均P0.01)。以UACR、FBS、PBS、UMCR、e GFR、TGF-β1基因调控区甲基化水平作为自变量,血清TGF-β1含量作为因变量,进行多元逐步回归分析,提示e GFR(β=-0.690,P0.01)和基因甲基化(β=-0.302,P0.01)和血清TGF-β1相关,提示它们是影响血清TGF-β1蛋白表达的因素。7.血清TGF-β1蛋白水平与甲基化呈负相关(rs=-0.925,P0.01),与肾脏病理改变的严重程度呈正相关(rs=0.847,P0.01)。同时DN组甲基化水平和病理分级相关(χ2=23.667,P=0.04)。结论:1.随着糖尿病病程的延长,TGF-β1基因调控区甲基化水平逐渐降低,以DN组最低。同时,血清TGF-β1含量逐渐升高,以DN组最高,提示高糖可能通过诱导TGF-β1基因调控区去甲基化,促进TGF-β1基因表达。2.血管紧张素II-1型受体抑制剂(氯沙坦)治疗使血清TGF-β1降低,可能与抑制TGF-β1基因表达调控区去甲基化机制有关。
[Abstract]:Transforming growth factor - 尾 ( TGF - 尾 ) is a kind of secreted polypeptide molecule , and belongs to the TGF superfamily . The expression of TGF - 尾1 in diabetic nephropathy ( DN ) is the most prominent expression of TGF - 尾1 in diabetic nephropathy ( DN ) . Results : 1 . The level of DNA methylation of TGF - 尾1 gene was significantly higher in the patients with DN than that in DN group . The DN group was 7.47 卤 1.09 ng / L , the LOS group was 5.41 卤 0.51 ng / L , IL - 8 , Con group was 54.84 卤 2.36 ng / L , the DM group was 147.68 卤 5.70 ng / L , the DN group was 289.09 卤 30.79 ng / L , the LOS group was 160.13 卤 14.61 ng / L , the tumor necrosis factor ( TNF ? ) ? The levels of serum TGF - 尾1 were significantly lower in the group of Con A , DM group and DN group than in DN group . The levels of serum TGF - 尾1 were significantly lower than those of DN group . The level of TGF - 尾1 was negatively correlated with methylation ( rs = - 0.925 , P0.01 ) . At the same time , the methylation level and pathological grade of DN group were correlated ( 蠂2 = 23.667 , P = 0.04 ) . Conclusion : 1 . With the prolongation of diabetes course , the methylation level of TGF - 尾1 gene is decreasing gradually in DN group . At the same time , the content of TGF - 尾1 in serum is the highest in DN group . It is suggested that high glucose may induce TGF - 尾1 gene expression . 2 . Angiotensin II - 1 receptor inhibitor ( losartan ) can decrease the serum TGF - 尾1 gene expression and may be related to the inhibition of TGF - 尾1 gene expression regulation region demethylation mechanism .
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9

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