一株小麦内生镰孢霉产物的逐级分离及各级产物对兔软骨细胞的影响

发布时间：2018-08-28 11:58

【摘要】：大骨节病(Kaschin-Beck Disease, KBD)是一种地方性骨关节病,对人体的危害极大,至今,KBD发病原因与发病机制仍困扰着科学家。本实验从感染青海大骨节病病区粮食作物内生真菌的代谢产物出发,探讨其中究竟有哪种或哪些物质能够对软骨细胞造成损伤,从而为大骨节病病因的寻找提供一定的实验参考。本实验选取分离自青海大骨节病区小麦内生镰孢霉5-5-1菌株代谢产物中对软骨细胞损伤严重的石油醚分部进行实验。通过硅胶柱层析、薄层层析(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、气相-质谱联用(GC/MS)等方法,对石油醚分部的代谢产物进行逐级分离。主要通过MTT检测软骨细胞存活率,免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白的合成量,甲苯胺蓝染色(toluidine blue, TB)检测蛋白聚糖的合成量,半定量RT-PCR实验检测Ⅱ型胶原蛋白与蛋白聚糖mRNA的表达量来逐级筛选能造成兔软骨细胞损伤的目标物质。实验结果显示,从石油醚分部中经柱层析粗分离得到的A、B、C、D、E、F、G、H这8组样品中,E、F、G样品均能够抑制软骨细胞的存活率、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的合成及其mRNA的表达,且均呈一定的浓度与时间效应。鉴于相同浓度下F样品对兔软骨细胞各项指标的影响最大,因此对F样品再进行HPLC分离。根据HPLC图谱结果,将其分为F1、F2、F3三部分。将它们分别作用于兔软骨细胞,结果显示F1、F2样品能对软骨细胞的存活率、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的合成及其mRNA的表达均产生抑制作用。而F3样品对兔软骨细胞的各项指标均无影响。对F1样品进行GC/MS分析,显示F1中可能存在镰孢霉毒素蛇形菌素(4,15-diacetoxyscirpenol, DAS),经HPLC分析与DAS标准品进行对比验证,确认DAS的存在,且不同浓度的DAS对软骨细胞的存活率、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的合成及其mRNA的表达均产生抑制作用,呈一定的浓度与时间效应,这是关于该毒素对软骨细胞有毒损作用的首次报道。同样对F2样品进行HPLC与GC/MS分析,发现其成分较复杂,有待进一步分离纯化鉴定。以上实验结果表明,镰孢霉5-5-1菌株代谢产物石油醚提取物分级分离产物中含有DAS及其他能够损伤软骨细胞的物质,并证实了KBD病区植物内生真菌代谢产物中含有多种损伤软骨细胞的物质,这些研究结果将为大骨节病病因的研究提供新的参考。
[Abstract]:Kaschin-Beck disease (Kaschin-Beck Disease, KBD) is a kind of endemic osteoarthropathy, which is harmful to human body. Based on the metabolites of endophytic fungi of grain crops in the area infected with Kashin-Beck disease in Qinghai Province, this study was conducted to explore which of these substances could damage chondrocytes. So as to provide a certain experimental reference for the search for the cause of Kaschin-Beck disease. In this experiment, petroleum ether was isolated from the metabolites of endophytic Fusarium falcifera 5-5-1 isolated from Kashin-Beck disease area of Qinghai province. The metabolites of petroleum ether were separated step by silica gel column chromatography, thin layer chromatography (TLC), (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC),) and GC-MS (GC/MS). The survival rate of chondrocytes was determined by MTT, the synthesis of collagen 鈪，

本文编号：2209329