【摘要】：背景:Peroxiredoxin Ⅱ(Prx Ⅱ)是一种典型的含有2-Cys残基的过氧化物还原酶,在哺乳动物的细胞中广泛表达。Prx Ⅱ通过C端Cys的巯基与另1分子N端Cys的巯基发生氧化还原反应,形成二硫键,清除H2O2。2010年发表在《ANTIOXIDANTSREDOX SIGNALING》一篇论文的结果显示:real time-PCR检测到小鼠腹腔注射STZ后,胰腺组织中Prx Ⅱ的mRNA转录水平与对照组相比明显下降。STZ的分子中有氨基葡萄糖结构,能够特异性通过GLUT2进入胰岛β-cell,产生氧化应激导致胰岛β-cell损伤,诱导血糖升高。虽然Prx Ⅱ的作用研究十分广泛,但是Prx Ⅱ在STZ诱导的胰岛β-cell损伤过程中的作用尚不清楚,为了深入研究Prx Ⅱ在STZ诱导的胰岛β-cell损伤中的保护作用,本实验利用Prx Ⅱ基因敲除小鼠(Prx Ⅱ~(-/-))和Prx Ⅱ敲降的Min6小鼠胰岛素瘤细胞研究Prx Ⅱ在STZ诱导的胰岛β-cell损伤中的保护作用。方法:体内实验,利用单次200 mg/kg的STZ和连续5次50 mg/kg/次的STZ(1次/d),腹腔注射6-8周龄的Prx Ⅱ~(+/+)和Prx Ⅱ~(-/-)小鼠诱导胰岛β-cell损伤,采用HE染色观察小鼠胰岛组织形态学变化,血糖仪检测小鼠血糖水平和ELISA检测小鼠血清中胰岛素水平;腹腔注射2 g/kg的葡萄糖(IPGTT)和1 IU/kg的胰岛素(IPITT)分别检测小鼠血糖情况。体外实验,利用慢病毒侵染Min6细胞构建稳定遗传的空载体Min6细胞(Scramble)和Prx Ⅱ敲降的Min6细胞(shPrx Ⅱ)。首先,采用MTT实验检测STZ对Scramble和shPrx Ⅱ的细胞毒性作用;然后,采用流式细胞术和原位荧光染色检测5 mM STZ处理Scramble和shPrx Ⅱ不同时间下细胞周期、细胞凋亡和ROS水平情况;最后,采用Western blotting检测细胞周期、细胞凋亡以及相关信号转导蛋白的表达水平。结果:体内实验,小鼠经STZ腹腔注射后,(39)(5)(36)染色观察到两种小鼠的胰岛β-cell均发生细胞死亡,且Prx Ⅱ~(-/-)小鼠胰岛β-cell死亡的程度明显高于Prx Ⅱ~(+/+)小鼠;ELISA结果显示,Prx Ⅱ~(-/-)小鼠的胰岛素水平显著低于Prx Ⅱ~(+/+)小鼠;小鼠血糖检测发现两种小鼠的血糖显著升高,且在相同时间下Prx Ⅱ~(-/-)小鼠的血糖显著高于Prx Ⅱ~(+/+)小鼠,IPGTT也得到相似的结果。体外实验,成功构建能稳定遗传的Prx Ⅱ敲降的Min6小鼠胰岛素瘤细胞(shPrx Ⅱ);MTT实验结果显示,随着STZ处理浓度的增加、时间的延长,Scramble和shPrx Ⅱ细胞的存活率都下降,且在相同处理浓度下、时间下shPrx Ⅱ细胞的存活率显著低于Scramble细胞;流式细胞术检测发现随着5 mM STZ处理时间的延长,Scramble和shPrx Ⅱ细胞发生G2/M期阻滞、细胞凋亡和ROS水平升高,且在相同处理时间下shPrxⅡ细胞的G2/M期阻滞和凋亡显著高于Scramble细胞,在9 h,18 h时shPrx Ⅱ细胞的ROS水平显著高于Scramble细胞;原位荧光染色结果发现随着5 mM STZ处理时间的延长,Scramble和shPrx Ⅱ细胞的凋亡增加,且在相同处理时间下shPrx Ⅱ细胞的凋亡显著高于Scramble细胞;Western blotting结果发现细胞周期相关蛋白(P21、P16、CyclinB1)和促凋亡相关蛋白(Bad、Bax、Cleavaged-caspase3)的表达水平随着5 mM STZ处理时间的延长而增加,且在相同处理时间下shPrx Ⅱ细胞中相关蛋白的表达水平显著高于Scramble,而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达水平随着5 mM STZ处理时间的延长而降低,且在相同处理时间下shPrx Ⅱ细胞中Bcl-2和Bcl-xl蛋白的表达水平显著低于Scramble细胞。P-AKT、P-GSK-3b、P53和P-P53的表达水平随着5 m M STZ处理Scramble和shPrx Ⅱ细胞时间的延长而减少,且在相同处理时间下shPrx Ⅱ相关蛋白磷酸化水平显著低于Scramble细胞。结论:以上结果说明,在胰岛β-cell受到STZ损伤时,Prx Ⅱ的缺失使胰岛β-cell大量死亡导致血糖升高,Prx Ⅱ的敲降会导致P-AKT、P-GSK-3b、P53和P-P53的表达水平下降,导致胰岛β-cell发生G2/M期阻滞和凋亡。因此,Prx Ⅱ可能通过调控P-AKT、P-GSK-3b、P(20)(18)和P-P53的表达水平保护胰岛β-cell。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.1
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