溶酶体膜蛋白Sidt2对胰岛素颗粒分泌的影响及机制

发布时间：2018-10-20 13:42

【摘要】：目的:前期研究发现溶酶体膜蛋白Sidt2剔出小鼠表现出糖代谢紊乱和胰岛素分泌受损,本研究在此基础上围绕胰岛素分泌相关蛋白等的检测来进一步探讨Sidt2影响胰岛素分泌的具体机制,深化对溶酶体膜蛋白Sidt2与糖尿病发病相关性的认识,丰富糖尿病的发病机制理论。方法:1、将野生型小鼠与Sidt2~(-/-)小鼠合笼,基因型的鉴定采用鼠尾DNA,接着同笼交配子代Sidt2~(+/-)杂合子小鼠,最后选取子代Sidt2~(-/-)雄鼠为实验组,对照组是同窝或者同一个批次出生的Sidt2~(+/+)野生型雄鼠。进行DNA鉴定后行胰岛的光学显微镜和解剖显微镜观察。2、检测Sidt2~(+/+)和Sidt2~(-/-)小鼠的糖耐量。3、对Sidt2~(+/+)和Sidt2~(-/-)小鼠的胰腺组织进行insulin的免疫组化检测。4、在离体水平通过Western blot检测小鼠胰岛中参与胰岛素分泌的关键蛋白:SNAP25、VAMP1、Syntaxin、Syntaxin1的表达。5、运用小干扰RNA技术在INS1细胞水平敲降Sidt2,并通过western blot检测细胞水平中参与胰岛素分泌关键蛋白的表达。6、检测高糖刺激下,Sidt2敲降的INS1细胞的胰岛素分泌情况。7、运用过表达载体在INS1细胞水平过表达Sidt2,并通过western blot检测细胞水平中参与胰岛素分泌关键蛋白的表达。8、Sidt2基因启动子序列设计三对引物,分别以98例2型糖尿病患者和67例正常人血清DNA为模板,进行PCR,并对扩增产物进行测序,寻找单核苷酸突变位点,并对找到的单核苷酸突变位点进行统计学分析。结果:1、从DNA分子水平证明Sidt2~(-/-)基因剔除小鼠模型构造是成功的。2、Sidt2~(-/-)小鼠在生长发育、皮毛的光泽以及应激反应等一般方面相较于野生型均是落后的。光学显微镜和解剖显微镜的观察发现,对照组的胰岛体积较大、形态规则饱满、数量较多;而Sidt2~(-/-)小鼠的胰岛体积较小、形态多不规则、数量较少。3、免疫组化检测发现Sidt2~(-/-)小鼠胰腺组织的insulin表达量相较于对照组的表达量是降低的(P0.05)。4、Western blot检测发现参与胰岛素分泌的关键蛋白:SNAP25、VAMP1、Syntaxin的表达在Sidt2~(-/-)小鼠中相较于野生型小鼠是降低的(P0.05)。5、在大鼠胰岛肿瘤细胞INS1水平上用质粒干扰Sidt2的表达,发现VAMP1的表达在Sidt2敲降的INS1细胞中相较于空白对照组的INS1是降低的(P0.05)。6、在大鼠胰岛肿瘤细胞INS1水平上用过表达载体过表达Sidt2,发现敲降状态下的SNAP25、VAMP1、Syntaxin的表达的下降被纠正了。7、在动物水平和细胞水平两方面证实了Sidt2剔除可以导致糖代谢发生异常。8、发现三个单核苷酸突变位点:A1521G,G1816A,C502A,其中C502A在2型糖尿病患者和正常对照组之间差异有统计学意义。结论:1、Sidt2~(-/-)可影响小鼠胰岛形态,主要表现为胰岛细胞的体积变小、形态不规则、胰岛数量减少。2、Sidt2作为多重跨膜溶酶体膜蛋白参与了胰岛素颗粒的分泌过程。Sidt2剔除导致糖代谢紊乱并抑制了胰岛素分泌的关键囊泡蛋白SNAP25、VAMP1、Syntaxin的表达进而阻碍了胰岛素分泌颗粒的正常胞吐,导致胰岛细胞的胰岛素分泌障碍,最终进入糖尿病阶段。3、在细胞的水平进一步验证了Sidt2的缺失对于SNARE蛋白表达的下调作用,并且这种下调作用可以被外源性转入Sidt2后纠正。4、C502A和中国汉族人群2型糖尿病相关,其中CA基因型可能增加中国汉族人群2型糖尿病的患病风险。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.1

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本文编号：2283351