脂肪源间充质干细胞移植治疗狼疮鼠疗效的实验研究

发布时间：2018-11-08 14:48

【摘要】：研究背景系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种破坏性的自身免疫性疾病,能损伤多个器官系统,以自身抗体产生、免疫复合物形成、慢性炎症和终末器官损伤为主要特征。抗原抗体复合物产生后沉积在小血管、皮肤基底膜、肾脏等各个器官系统。该病的临床表现主要集中在皮肤、肾脏、肌肉骨骼和血液系统,但也可以影响肺部、中枢神经系统、浆膜和几乎其他所有的器官系统。SLE的流行病学调查显示,世界范围内均有SLE发生,但在不同国家和地区间存在明显差异。我国SLE的患病率较高,且有逐年上升的趋势。目前,系统性红斑狼疮的发病机制并没有研究的十分清楚。一般认为SLE受多种因素的影响,包括遗传基因的影响,生长环境因素的影响,雌性激素和性别的影响,基因表达表观遗传调控的影响,免疫细胞及细胞因子的影响。由于机体免疫监视或免疫抑制能力的不足,导致体内的免疫细胞持续处于过度激活状态,可能在SLE的免疫发病机理中起着重要作用。体内多种细胞发生调节异常使得SLE的治疗十分困难,因为广泛的免疫抑制必带来较多的副作用。目前SLE的治疗主要采用糖皮质激素联合免疫抑制剂的使用,这种疗法大多数情况下是有效的,但在一些难治性、重症红斑狼疮的治疗中效果不佳且不良反应多。为了治愈自身免疫性疾病,我们迫切需要找到一种既能抑制自身免疫细胞,又能不影响机体其他的免疫系统工作的新的疗法。随着对自身免疫性疾病的致病机理的深入了解,越来越多的学者开始将目光投向干细胞治疗。干细胞是一类非常与众不同的细胞群体。尽管来源不同,干细胞都有两个特征性的属性。首先,在一定条件下,干细胞具有持续的、无限制的自我更新能力。其次,干细胞保留了分化为许多其他特殊类型细胞的潜能。造血干细胞(hemopoietic stem cell,HSC)移植是目前应用较多的一种干细胞疗法。异体造血干细胞存在风险大、匹配供体寻找难度大、移植后存在免疫排斥反应等缺点。为了解决这些难题,研究者们开始寻找其他的干细胞。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)是一种能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞的多能干细胞,具有诱导免疫耐受、免疫抑制的作用,且免疫原性低,能够避免同种异体排斥反应。因此移植无需进行基因配型,在包括系统性红斑狼疮在内的自身免疫性疾病治疗方面的有十分广阔的应用前景。最早被认识的MSC来源于骨髓,即骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC),获取骨髓间充质干细胞需要大量的骨髓,给供体带来了痛苦以及感染的风险等,这些限制了骨髓间充质干细胞的应用。世界各地的研究者开始寻找新的间充质干细胞来源,包括牙髓组织、脐带血、胎盘、脂肪等等,这其中脂肪来源最为引人注意。相比于骨髓来源的间充质干细胞,脂肪源间充质干细胞(adipose-derived stem cell, ADSC)或称脂肪间充质干细胞,拥有来源丰富、易于采集、含量较多、供体所受痛苦小、伦理学限制少等优点,是近年来间充质干细胞研究中的主要内容。ADSC具有MSC的特性,能分化成骨、软骨、心肌、平滑肌、脂肪、神经及内皮等多种组织细胞,也具有类似BMSC的免疫调节活性。已经有一些研究证实了ADSC在神经损伤修复、心肌损伤修复、免疫性疾病治疗等方面的作用,大多采用人的间充质干细胞进行试验。因为后续实验需要用到的狼疮鼠动物模型是小鼠,所以本实验采用了同种异基因的小鼠作为提取脂肪间充质干细胞的来源。虽然间充质干细胞移植治疗已经临床上有应用,但MSC治疗的确切机理还没有阐述清楚,文献中报道的机制包括：MSC的免疫抑制作用是通过活化或促分化Treg细胞来产生的；MSC通过分泌大量的IL-10或TGF-β1,这些细胞因子可以让抗原提呈细胞的成熟受到抑制,能诱导T细胞不产生免疫反应；MSC可以使活化T细胞发生凋亡,同时阻止T细胞的增殖,来发挥免疫抑制作用等。自身抗体在系统性红斑狼疮患者多器官功能障碍中发挥着至关重要的作用,抗ds-DNA抗体的升高是判定SLE患者自身免疫活跃的标准之一。本实验通过观察抗ds-DNA抗体是否下降来评估ADSC治疗狼疮鼠是否有效。随着研究的不断深入,人们认识到Th17细胞及其分泌的特征性细胞因子IL-17在SLE等自身免疫疾病的发病机制中发挥了关键的作用。IL-17缺失的小鼠不能诱导出以狼疮抗体表达升高、狼疮性肾炎为表现的红斑狼疮。那么,ADSC治疗能否使狼疮鼠的IL-17的表达减少呢?RORyt是调控Th17细胞分化及主要效应细胞因子IL-17表达的关键性转录因子。RORyt可通过调节IL-17对受Thl7细胞影响的疾病发挥作用。是否ADSC是通过RORyt来调节IL-17的产生和释放呢?用于自身免疫病研究的动物模型有很多种类,其中B6.MRL-Faslpr/J小鼠是目前比较常用的研究系统性红斑狼疮的动物模型,小鼠30周龄左右可出现全身性的自身免疫反应,表现为淋巴结肿大、肾小球性肾病。本实验拟通过对系统性红斑狼疮模型鼠进行同种异基因脂肪间充质干细胞移植治疗,观察其疗效和安全性,从而为临床应用提供实验室证据。并通过对相关转录因子和细胞因子的研究来探索其可能的作用机制。目的研究同种异基因脂肪间充质干细胞移植对系统性红斑狼疮鼠体重、尿蛋白、抗ds-DNA抗体及肾脏的病理变化等主要指标的影响,以及对肾脏RORγt、 IL-17mRNA表达量的影响,探讨其在体内可能的作用机制。方法1.采用Ⅰ型胶原酶消化法分离小鼠脂肪间充质干细胞,并在体外培养传代。观察细胞形态,取第3代生长良好的细胞用流式细胞仪进行细胞表型的鉴定。2.将雌性B6.MRL-Faslpr/J狼疮鼠分为2组,每组5只(2组动物在分组时体重、尿蛋白浓度无差别)；同龄雌性C57BL/6小鼠5只为正常对照组。ADSC治疗组：从32周龄时从尾静脉注入第1-3代ADSC (0.1X106个细胞每10g体重),1次/2周,共3次；狼疮鼠组及正常对照组：以等量的生理盐水代替ADSC进行尾静脉输注。3.主要指标检测：考马斯亮蓝法(Brandford法)检测尿蛋白浓度；酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清抗ds-DNA;常规组织病理H.E染色观察小鼠肾脏的病理改变；免疫荧光病理观察IgG在小鼠肾脏的沉积；实时荧光PCR检测肾脏组织中RORγt、IL-17mRNA的表达。统计学处理应用SPSS13.0软件进行分析,实验数据以均数±标准差(错误!未找到引用源。±SD)表示,统计方法采用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差齐时组间比较采用Bonferroni法,方差不齐时组间比较采用Dunnett T3法。当P0.05时,差异显著,有统计学意义。结果1.小鼠脂肪间充质干细胞贴壁生长,为长梭形或多角形,原代培养时24h-72h内贴壁,约10-14d后细胞融合达80%以上,排列呈成束状交织或成漩涡状。第3代ADSC细胞表面CD29表达率为99.66%,CD34表达率为1.41%,CD45表达率为0.3%,CD44表达率为72.58%,CD90表达率为90.23%,与脂肪间充干细胞的细胞表型相符。2.①实验共进行8周,各组小鼠均未出现死亡,进食情况、精神状况、体重无明显差别。②实验前狼疮鼠组和ADSC治疗组的尿蛋白浓度无统计学差异(P0.05)；狼疮鼠组尿蛋白浓度较正常对照组明显升高,ADSC治疗组的尿蛋白浓度显著低于狼疮鼠组(P0.05)。③狼疮鼠组的血清抗ds-DNA抗体浓度较正常对照组明显升高,ADSC治疗组的血清抗ds-DNA抗体浓度显著低于狼疮鼠组(P0.05)。④肾脏病理H.E染色观察：狼疮鼠肾小球系膜细胞、系膜基质增生,炎细胞浸润；ADSC治疗组小鼠肾小球肾炎病理改变较狼疮鼠组小鼠减轻；正常对照小鼠肾小球系膜细胞及系膜基质无明显增生。肾脏免疫荧光病理观察：狼疮鼠组小鼠的肾小球有较多免疫复合物沉积；治疗组小鼠肾小球免疫复合物沉积较狼疮鼠组小鼠减少；正常对照小鼠肾小球无明显免疫复合物沉积。3.狼疮鼠组肾脏IL-17mRNA的表达量较正常对照组明显升高,ADSC治疗组IL-17mRNA的表达较狼疮鼠组降低。狼疮鼠组肾脏RORymRNA表达量高于正常对照组,ADSC治疗组RORytmRNA的表达量少于狼疮鼠组。结论1.小鼠ADSC能在体外分离培养,细胞贴壁生长,为长梭形或多角形,融合是时排列呈成束状交织或成漩涡状。阳性表达CD29、CD44及CD90,不表达CD34、CD45等造血干细胞表面标志。2.脂肪间充质于细胞移植可减少B6.MRL-Faslpr/J狼疮鼠血清自身抗ds-DNA抗体浓度,减轻肾功能损伤所致的蛋白尿及IgG型免疫复合物在肾脏的沉积,对系统性红斑狼疮有治疗作用。3. ADSC可能通过下调转录因子RORyt的表达来抑制Th17细胞特征性的细胞因子IL-17的表达和释放,从而起到治疗红斑狼疮的作用。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.241

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