NEK7-NLRP3炎性小体信号通路在系统性红斑狼疮发病中的作用

发布时间：2018-11-21 18:41

【摘要】：研究背景:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus.SLE)多见于育龄期青年女性,病理变化以炎症反应、血管异常为主的慢性自身免疫性疾病。环境及遗传因素、激素水平和免疫调节因子等多种机制参与了疾病的发生发展,固有免疫及适应性免疫系统均在SLE发病过程中扮演重要角色。作为人体重要的免疫屏障系统,固有免疫系统具有清除外来病原体和激活适应性免疫应答的作用。通过模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs),固有免疫系统识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)发挥屏障作用。目前,已经发现的PRRs中,一些NOD样受体(nucleotide binding oligome-rization domain-like receptors,NLRs)被激活后形成一种胞内高分子蛋白复合体,称为"炎性小体"或"炎症小体"。炎性小体可以激活半胱天冬酶-1(cysteinyl aspartate-specific proteinase,Caspase-1),诱导白介素-]beta(interleukin-1 beta,IL-1b)、白介素18(interleukin-18,1L-18)的产生及活化,参与调节机体的免疫、炎症反应。已报道的炎性小体主要有四种:Nod样受体蛋白1(Nod-like receptor protein1,NLRP1)、Nod样受体蛋白3(Nod-like receptorprotein3,NLRP3)、IPAF(ice-protease-activating factor,IPAF)及AIM2(absent in melanoma 2,AIM2),其中NLRP3炎性小体能够被多种病原体激活,如细菌、病毒、代谢产物、结晶体等,是目前研究最广泛的炎性小体。在本课题组先前的研究究中发现SLE患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中NLRP3炎性小体呈低表达,且与疾病活动呈负相关,给予药物治疗后NLRP3炎性小体组分表达量显著升高,提示其可能在SLE发病中起到保护性作用,但具体机制不详。近期,研究发现NIMA相关蛋白激酶7(never in mitosis gene A related kinase7,NEK7),一种具有调控细胞周期、促进细胞有丝分裂功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是激活NLRP3炎性小体的关键蛋白。目的:探讨NEK7-NLRP3炎性小体信号通路在SLE患者PBMC中的表达及其临床意义。方法:选取2016年03月至2016年11月期间就诊于山东大学附属省立医院风湿免疫科的SLE患者38例(SLE组)及同期就诊于该院查体中心的健康人33例(健康对照组)。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time Polymerase Chain Reaction,real-time PCR)法和免疫印迹试验(western blotting)检测两组研究对象PBMC中NEK7、NLRP3炎性小体各组分(NLRP3、ASC、Caspase-1)及下游因子IL-1b、IL-18的mRNA、蛋白表达量,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunesorbent assay,ELISA)检测其血清IL-1b、IL-18表达量。采用同种方法检测25例治疗后SLE患者上述指标的表达量,分析治疗前后相关组分的变化,探讨其与SLE病情活动评价指标的相关性。结果:1.RT-PCR实验结果显示,与健康对照组相比,SLE组PBMC中NEK7、NLRP3、ASCmRNA呈低表达(P=0.0004;P=0.0001;P=0.0005),而Caspase-1、IL-1b、IL-18 mRNA呈高表达(P=0.0001)。2.Western blotting实验结果显示,与健康对照组相比,SLE组PBMC中NEK7、NLRP3蛋白呈低表达(P=0.0317;P=0.0079),ASC蛋白表达无差异(P=0.8413),而Caspase-1、IL-1b、IL-18蛋白呈高表达(P=0.0159;P=0.009;P=0.016)。3.ELISA实验结果显示,SLE组血清IL-1b、1L-18表达量显著高于健康对照组(P=0.000),治疗后IL-1b、IL-18的表达水平明显下降(P=0.000)。治疗后SLE组血清IL-1b的表达量仍高于健康对照组(P=0.002),而治疗后IL-18的表达量较健康对照组无明显差异(P=0.495)。4.SLE组PBMC中NEK7、NIRP3炎性小体各组分及其下游细胞因子mRNA表达量之间的相关分析4.1 SLE组PBMC中,NEK7与NLRP3、ASC mRNA表达量存在正相关(r=0.3728,P=0.0274;r=0.4454,P=0.0073),而与Caspase-1、IL-1b、IL-18 mRNA表达量无相关性(r=-0.2930,P=0.0876;r=0.06625,P=0.7053;r=-0.1063,P=0.5433)。4.2 SLE组PBMC中,NLRP3与ASC mRNA表达量存在正相关(r=0.7157,P=0.0001),而与Caspase-1、IL-1b、IL-18 mRNA表达量均无相关性(r=-0.1521,P=0.3831;r=0.05126,P=0.7699;r=0.1441,P=0.4088)。4.3SLE组PBMC中,ASCmRNA表达量与Caspase-1、IL-1b、IL-18mRNA表达量均无相关性(r=-0.2000,P=0.2494;r=-0.02479,P=0.8876;r=0.1583,P=0.3638)。4.4 SLE组PBMC中,Caspase-1 mRNA表达量与IL-1b、IL-18 mRNA表达量存在正相关(r=0.4790,P=0.0036;r=0.7090,P=0.0001);IL-1bmRNA表达量与IL-18mRNA表达量亦存在正相关(r=0.4996,P=0.0022)。5.SLE组PBMC中NEK7、NLRP3炎性小体各组分及其下游细胞因子mRNA表达量与SLE病情活动评价指标(抗ds-DNA抗体、抗AnuA抗体及SLEDAI评分)的相关分析5.1 SLE组PBMC中,NEK7 mRNA水平与抗AnuA抗体呈负相关(r=-0.5630,P=0.0006),与抗ds-DNA抗体、SLEDAI评分无相关性(r=-0.2701、-0.2692,P=0.1166、0.2034)。5.2 SLE组PBMC中,NLRP3 mRNA水平与抗ds-DNA抗体、抗AnuA抗体及SLEDAI评分均呈负相关(r=-0.5453、-0.7087、-0.7430,P=0.0007、0.0001、0.0001)。5.3 SLE组PBMC中,ASC mRNA水平与抗ds-DNA抗体无相关性(r=-0.3261,P=0.0559),与抗AnuA抗体和SLEDAI评分呈负相关(r=-0.3722、-0.7667,P=0.0277、0.0001)。5.4 SLE组PBMC中,Caspase-1mRNA水平与抗ds-DNA抗体及SLEDAI评分无相关性(r=0.2281、0.1533,P=0.1876、0.3794),与抗AnuA抗体呈正相关(r=0.4361,P=0.0088)。5.5 SLE组PBMC中,IL-1bmRNA水平与抗ds-DNA抗体、抗AnuA抗体无相关性(r=-0.0230、0.1888,P=0.8956、0.2774),与SLEDAI评分呈正相关(r=0.7953,P=0.0001)。5.6 SLE组PBMC中,IL-18 mRNA水平与抗ds-DNA抗体、抗AnuA抗体及SLEDAI评分均呈正相关(r=0.4177、0.3498、0.5259,P=0.0125、0.0394、0.0012)。6.ELISA实验结果相关分析表明,SLE组血清IL-1b表达量与抗ds-DNA抗体、抗AnuA抗体、ESR 及SLEDAI 评分均呈正相关(r=0.584、0.504、0.566、0.624;P=0.002、0.010、0.003、0.001),与C3呈负相关(r=-0.398,P=0.049);SLE组血清IL-18表达量与抗ds-DNA抗体、ESR及SLEDAI评分亦呈正相关(r=0.544、0.512、0.612;P=0.005、0.009、0.010)。7.药物治疗后,SLE2组PBMC中NEK7、NLRP3 mRNA表达量较前升高:1.1189±0.5017 vs 2.4685±0.9712(P=0.025)、0.5726±0.1718 vs 0.9682±0.2675(P=0.024);ASC mRNA表达量治疗前后未见明显差异:1.0350±0.6351 vs 1.2686±0.8319(P=0.634);Caspase-1、IL-1b、IL-18 mRNA表达量治疗后较治疗前明显降低:1.6419±0.3514vs0.7687±0.2223(P=0.002)、7.1753±2.2051 vs3.2899±1.3161(P=0.010)、3.3933± 0.8431vs 1.4175± 0.2151(P=0.001)。8.药物治疗后,SLE组PBMC中NEK7、NLRP3蛋白表达量较前升高:1.9415±0.4547 vs3.0900±0.8325(P=0.027)、0.5056± 0.3042 vs 1.0066± 0.2865(P=0.046);ASC蛋白表达量治疗前后未见明显差异:0.8152±0.2222 vs 0.9048±0.1032(P=0.437);Caspase-1、IL-1b及IL-18蛋白表达量较治疗前显著降低:2.4149±0.6172 vs 1.2169±0.3724(P=0.006)、4.0684±0.0855 vs 3.7134±0.1129(P=0.001)、2.7540±0.8599vs 2.5211±0.1986(P=0.043)。9.与SLE无肾损害组相比,LN组PBMC中NEK7、NLRP3、ASCmRNA呈低表达:1.8173±0.7953 vs 1.0187±0.3036(P=0.002)、0.7432±0.2791 vs 0.4612±0.2317(P=0.004)、1.1426±0.4972 vs0.7455±0.2536(P=0.012);Caspase-1、IL-1b、IL-18 mRNA 呈高表达:1.4763±0.5189 vs 2.5654±0.6]86(P=0.000)、3.0022±2.0904 vs 7.6056±4.7246(P=0.000)、2.6668±1.4962 vs 5.9491±3.3549(P=0.000)。10.与SLE无肾损害组相比,LN组PBMC中NEK7、NLRP3、ASC蛋白呈低表达:2.4661±0.8916 vs 1.7945±0.9244(P=0.010)、0.8669±0.1290 vs 0.4779±0.1400(P=0.001)、1.1628±0.2963 vs 0.7191±0.1434(P=0.008);Caspase-1、IL-1b、IL-18 蛋白呈高表达:2.1471±0.9455 vs 3.5734±0.9081(P=0.024)、3.1865±1.0688 vs4.8724±0.8605(P=0.013)、2.6391±0.4480 vs 3.8800±0.3223(P=0.000)。结论:1.NEK7-NLRP3复合体的低表达与SLE疾病活动呈负相关,可能作为保护性因素参与SLE、LN的发病。2.SLE患者PBMC中NEK7对NLRP3呈正性激活作用,NLRP3的低表达可能与其NEK7的低表达有关。3.SLE患者PBMC中Caspase-1的高表达与NEK7、NLRP3及ASC均无相关性,提示SLE患者PBMC中Caspase-1的表达不仅受NLRP3的作用,亦受其他信号通路的调控。4.SLE患者PBMC中Caspase-1过度活化介导的IL-1b、IL-18的成熟与释放,参与了 SLE和LN的发病。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R593.241

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