尾加压素Ⅱ（Urotensin Ⅱ）及其受体GPR14高表达与人糖尿病大动脉病变相关性研究

发布时间：2018-11-25 21:04

【摘要】：研究目的明确尾加压素Ⅱ(urotensinⅡ,UⅡ)和它的特异性受体GPR14的高表达与人糖尿病大动脉病变的相关性,比较尾加压素Ⅱ及其受体GPR14在糖尿病人主动脉平滑肌细胞与非糖尿病入主动脉平滑肌细胞中的差异性表达,探寻糖尿病大动脉病变预防及治疗的新靶点、新途径。研究方法实验取临床心外科大血管手术或冠状动脉旁路移植手术中收集的主动脉组织,用组织块贴壁法培养人主动脉平滑肌原代细胞,形态学和免疫荧光法对血管平滑肌细胞进行鉴定,传代后选取第3-6代细胞备用。根据病人是否有糖尿病将取自标本培养的细胞分为糖尿病组和非糖尿病组,糖尿病组病人糖尿病史1年以上、平素血糖控制欠规律,术前平均血糖在11.1mmol/L以上,非糖尿病组病人术前平均血糖在正常范围(3.9-6.1mmol/L)。根据不同处理,糖尿病组和非糖尿病组再分别分为UⅡ组、UT拮抗组、对照组,分别给予UⅡ, UT拮抗剂、对照处理24h。采用细胞划痕实验检测UⅡ和UT拮抗剂对糖尿病和非糖尿病平滑肌细胞迁移的差异性影响；CCK-8细胞增殖实验对细胞增殖程度进行对比,明确UⅡ对糖尿病和非糖尿病平滑肌细胞促增殖作用的差别；提取各组细胞总蛋白和总mRNA分别行western blot和R T-PCR,明确糖尿病人和非糖尿病人血管平滑肌细胞中UⅡ和GPR14的差异性表达。所得数据应用SPSS19.0进行统计学处理。结果1.应用组织块贴壁法培养出人主动脉平滑肌原代细胞,传代后进行形态学观察,见细胞呈梭形或长梭形,可重叠生长,高低不平,呈典型的“峰-谷”样,这是血管平滑肌细胞特征性生长方式；免疫荧光鉴定：抗α平滑肌细胞肌动蛋白(抗α-SMA)见细胞胞浆显示绿色荧光,且纯度在90%以上。2.CCK-8增殖实验①随着时间的推移,各组OD值在一定范围内逐渐升高；②在糖尿病组(以下简称DM组)中,糖尿病UⅡ处理组(以下简称UⅡ+DM组)在每个时间点的细胞增殖活性均显著高于糖尿病UⅡ受体拮抗组(以下简称UT+DM组)(P0.01)和糖尿病对照组(以下简称DM对照组)(P0.01),UT+DM组细胞增值活性低于DM对照组(P0.05)；③在正常组中,UⅡ处理组(以下简称UⅡ+正常组)在每个时间点的细胞增殖活性均高于无糖尿病的UⅡ受体拮抗组(以下简称UT+正常组)(P0.05)和正常对照组(P0.05),UT+正常组与正常对照组无显著差别(P0.05)；④在各时间点,经UⅡ处理的DM组的细胞增殖活性高于UⅡ处理的正常组(P0.05)。3.细胞划痕实验①在糖尿病组中,UⅡ+DM组的细胞迁移距离显著大于UT+DM组(P0.01)和DM对照组(P0.01), UT+DM组小于DM对照组(P0.05)：②在正常组中,UⅡ+正常组的细胞平均迁移距离大于UT+正常组(P0.05)和正常对照组(P0.05),UT+正常组与正常对照组无显著差别(P0.05)；③在糖尿病组和正常组之间,UⅡ+D M组的细胞迁移距离大于UⅡ+正常组(P0.05)。4.免疫印迹(Western blot)和RT-PCR①在糖尿病组内, UII+DM组中UⅡ和其受体GPR14的蛋白表达量和mRNA表达量显著高于UT+DM组(P0.01)和DM对照组(P0.01), UT处理组UⅡ及其受体GPR14的蛋白表达量和nRNA表达量低于DM对照组(P0.05);②正常组内,UⅡ和其受体GPR14的蛋白表达量和mRNA表达量在UⅡ+正常组中的表达量也高于UT+正常组(P0.05)和正常对照组(P0.05),而它们在UT+正常组中的表达量与在正常对照组中的表达量并无显著差异(P0.05)；③UⅡ+DM组平滑肌细胞中UⅡ及其受体GPR14的蛋白表达量和mRNA表达量高于UⅡ+正常组(P0.05)。结论1.从全新的角度进一步证实UⅡ及其受体GPR14的高表达与人平滑肌细胞增殖、迁移密切相关。2.糖尿病人主动脉平滑肌细胞对UⅡ的敏感性高于非糖尿病人,更易发生迁移和增殖,从而更容易导致动脉粥样硬化发生,且糖尿病人的动脉粥样硬化比非糖尿病人的动脉粥样硬化病变程度重、范围大。此过程是通过GPR14介导的第二信使通路发挥复杂的细胞内反应所致。3.除了“尾加压素Ⅱ-GPR14”系统外,可能还存在其他因子通过其他通路或途径促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移,从而加快动脉粥样硬化的发生和发展。4.SB-657510作为一种磺胺类UⅡ受体拮抗剂,能显著抑制人动脉平滑肌细胞的增殖和迁移,延缓人糖尿病大血管病的进展,对糖尿病人的动脉粥样硬化具有一定的防治作用,具有广阔的抗动脉粥样硬化研究和应用前景。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2

【参考文献】