PMPs通过CXCR2介导的信号通路促进RA-FLS的迁移、侵袭

发布时间：2018-12-15 03:08

【摘要】：目的:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以关节滑膜炎、血管翳的形成、软骨及骨侵蚀破坏为主要病理改变的一种病因尚未明确的慢性炎症性自身免疫系统疾病。随着对RA疾病研究的深入,发现RA成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)迁移及侵袭能力的增强在RA的发病机制中起重要作用。血小板微颗粒(Platelet microparticles,PMPs)是血小板活化后脱落的胞膜颗粒。本课题组前期工作及文献报道显示RA患者外周血与关节腔中PMPs均异常增高,且PMPs的水平与RA疾病活动性相关,提示PMPs在RA的疾病的发生及发展中起一定作用。我们前期工作已发现PMPs可通过激活NF-κB通路,上调RA-FLS中MMP1的表达,进而促进了 RA-FLS迁移及侵袭。本研究的目的是明确PMPs中促进RA-FLS迁移、侵袭的主要活性成份,并探究其作用机制。方法:1.培养人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(MH7A),采用流式细胞仪以FITC标记的鼠抗人CD90、PE标记的鼠抗人CD55抗体进行细胞鉴定。2.选取新鲜机采富血小板血浆,使用ADP活化血小板,提取PMPs,并使用流式细胞仪以PE标记的鼠抗人CD41抗体进行纯度测定,进行定量。3.通过蛋白质谱分析PMPs中的主要成分。4.应用CCK-8试剂盒检测各种趋化因子受体拮抗剂对RA-FLS细胞活力的影响。5.利用细胞划痕、Transwell细胞迁移和侵袭实验探究各种趋化因子受体拮抗剂对PMPs诱导的RA-FLS迁移、侵袭能力的影响。6.通过高通量基因芯片检测PMPs对RA-FLS中相关基因表达的影响。使用RT-qPCR从mRNA水平、Western Blot从蛋白水平验证基因芯片的结果。7.使用Western Blot方法研究PMPs促进RA-FLS迁移、侵袭的主要活性成份及其作用机制。研究结果:1.流式细胞仪鉴定MH7A的CD90、CD55的阳性表达率为95.6±1.36%(n=3),确定其性质,可用于后期实验。2.流式细胞仪鉴定,提取的PMPs纯度达93.4± 1.46%(n=3),可用于后期实验。3.PMPs蛋白组学分析结果显示PMPs中含有5256种蛋白,GO分析表明这些蛋白质涉及到生物学过程、细胞组成、分子功能和信号通路等方面。PMPs中含有多种与细胞迁移及侵袭相关的趋化因子,如CCL5、CCL23、CXCL4及CXCL7等。4.CCK-8细胞活力检测实验结果表明实验选择的受体拮抗剂BX471(CCR1拮抗剂)、AMG487(CXCR3 拮抗剂)、STI571(CXCR3 拮抗剂)、SB225002(CXCR2 拮抗剂)对细胞活力均无明显影响(P0.05)。5.细胞划痕、Transwell细胞迁移实验表明BX471、AMG 487、STI571对PMPs促进RA-FLS迁移的作用无明显影响(P0.05);SB225002具有部分阻断PMPs促进RA-FLS迁移的作用(P0.05)。6.Transwell细胞侵袭实验表明SB225002具有部分阻断PMPs促进RA-FLS侵袭的作用(P0.05)。7.高通量基因芯片检测显示25 μgml及50μg/ml PMPs明显上调了 RA-FLS中CXCL5的mRNA的表达。RT-qPCR、Western Blot检测证实PMPs可上调RA-FLS中CXCL5的表达(P0.05)。8.Western Blot 实验结果显示 SB225002 可下调 RA-FLS 中 p-IκB、p-NF-κB(P0.05);PMPs 一方面可以下调RA-FLS中IκB的表达,另一方面可以上调RA-FLS中p-IκB的表达,而SB225002+50 μg/ml PMPs组与50 μg/ml PMPs组相比上调RA-FLS中IκB的表达,且下调 RA-FLS 中 p-IκB 的表达(P0.05);PMPs 可上调 RA-FLS 中 p-NF-κB 的表达,SB225002+50 μg/ml PMPs组与50μg/ml PMPs组相比RA-FLS中p-NF-Kb的表达明显减少(P0.05),提示SB225002可拮抗PMPs活化RA-FLS中IκB、NF-κB的作用。结论:1.CXCR2拮抗剂(SB225002)不仅可以抑制RA-FLS的迁移及侵袭,而且可以抑制PMPs诱导的RA-FLS的迁移及侵袭。2.PMPs可通过CXCR2介导的信号途径激活NF-κB通路促进RA-FLS的迁移及侵袭。
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【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R593.22
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本文编号：2379857