细胞因子TWEAK及BAFF在多发性肌炎和皮肌炎发病中的作用

发布时间：2018-12-28 14:37

【摘要】：特发性炎性肌病是一类主要累及骨骼肌组织的自身免疫性疾病,多发性肌炎和皮肌炎是最常见的两个疾病亚型。患者临床上突出表现为肌无力与肌肉耐力降低、血清肌酸激酶升高、产生自身抗体、肌肉组织中发生炎性细胞浸润,还会累及肺脏、心脏、肾脏、皮肤等多个脏器。多发性肌炎和皮肌炎已成为危害我国人民群众身体健康的重大疾病之一,但其病因和发病机制仍不明确。现在普遍认为天然免疫、获得性免疫、以及非免疫学机制共同作用,导致肌炎患者骨骼肌损伤。肿瘤坏死因子样凋亡弱诱导物(TWEAK)是肿瘤坏死因子超家族成员,是一种多功能细胞因子,通过结合并活化其受体Fn14参与多种细胞生理过程的调控。研究发现多种自身免疫性疾病如类风湿关节炎、硬皮病、系统性红斑狼疮中TWEAK表达异常,提示TWEAK在自身免疫病中可能具有重要的作用。但是,TWEAK-Fn14在多发性肌炎和皮肌炎患者中的表达情况仍不清楚。因此,为了研究TWEAK-Fn14在多发性肌炎和皮肌炎发病机制中的可能作用,我们检测了多发性肌炎和皮肌炎患者血清及肌肉组织中TWEAK-Fn14的表达水平,并初步探讨了TWEAK对成肌细胞的刺激效应,为阐明TWEAK-Fn14在多发性肌炎和皮肌炎中的作用提供实验证据。现有的多发性肌炎和皮肌炎血清生物标记物,包括血清肌酸激酶、自身抗体、细胞因子等,均不能理想的反映全部患者的疾病活动情况。因此,研究和探索新的血清标记物,对于更好的评估患者疾病活动性、指导患者的临床治疗和预后评估,具有重要的意义。B细胞活化因子(BAFF)是肿瘤坏死因子超家族成员之一,研究证实BAFF水平在多种自身免疫性疾病中表达显著升高并且可能作为指示疾病活动性的血清标记物。但是,中国人群多发性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF表达水平及其与患者疾病活动度的相关性仍不清楚。为此,本研究拟检测多发性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF浓度并分析其临床相关性；同时,通过设计横断面研究和随访研究,证实多发性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF浓度和患者疾病活动度的相关性,进而阐明血清BAFF浓度作为患者疾病活动性评估的血清生物标记物的临床应用价值。本研究获得主要研究结果如下：一.TWEAK及其受体Fn14在多发性肌炎和皮肌炎中的表达及在发病机制的作用1.多发性肌炎和皮肌炎患者血清TWEAK水平的检测通过检测98例多发性肌炎和皮肌炎患者、37例健康对照血清TWEAK浓度,发现患者组血清TWEAK水平(中位数442 pg/ml, range 81-1385 pg/ml)显著低于较健康对照组(中位数516 pg/ml, range 282-797 pg/ml, P0.001);血清TWEAK浓度在多发性肌炎患者组和皮肌炎患者组之间没有统计学差异(P0.05)。临床相关性分析显示患者血清TWEAK浓度与自身抗体、血清CK浓度、患者的临床症状(肺间质病变、吞咽困难、技工手、雷诺现象等)均无显著相关性(P均0.05)。横断面研究结果显示患者血清TWEAK浓度与疾病活动性评分无显著相关性(P均0.05)；对12例新发病患者治疗前后的血清TWEAK浓度和疾病活动度评分进行分析,结果显示治疗之后,患者疾病活动性评分显著下降(P0.01),但是患者血清TWEAK水平并不随着疾病活动度下降而变化。2.多发性肌炎和皮肌炎患者肌肉组织中Fn14 mRNA表达水平显著升高取17例多发性肌炎、19例皮肌炎患者、以及10例无肌病创伤患者的骨骼肌组织,进行定量RT-PCR方法检测TWEAK、Fn14的mRNA水平,结果显示,多发性肌炎和皮肌炎患者肌肉TWEAK mRNA水平与对照组无显著差异(P0.05)；而患者肌肉中Fn14 mRNA水平显著高于健康对照(P0.01)；并且,多发性肌炎患者组和皮肌炎患者组Fn14 mRNA水平无统计学差异(P0.05)。我们发现,合并吞咽困难的多发性肌炎和皮肌炎患者肌肉Fn14 mRNA水平显著高于未合并吞咽困难的患者(P0.01)。此外,患者肌肉Fn14 mRNA水平与肌肉活动性评分显著相关(r=0.512,P0.01),但是与总活动性评分不相关(P0.05)。3.多发性肌炎和皮肌炎患者骨骼肌组织中TWEAK、Fn14蛋白表达检测利用间接免疫荧光法检测了10例多发性肌炎、13例皮肌炎、7例健康对照肌肉组织中TWEAK、Fn14蛋白的表达,结果显示：多发性肌炎和皮肌炎患者患者肌肉组织中,可检测到高表达TWEAK和Fn14蛋白,健康对照肌肉组织中未检测到TWEAK、Fn14蛋白的明显表达；此外,在多发性肌炎和皮肌炎患者肌肉组织中,TWEAK蛋白主要由浸润的淋巴细胞表达,但是在肌细胞膜上也可以检测到TWEAK蛋白,而Fn14主要表达于肌细胞膜表面。因此免疫荧光双重染色共表达分析中,可见TWEAK和Fn14常常同时出现在肌细胞膜表面。4. TWEAK刺激成肌细胞的功能研究体外培养的人骨骼肌成肌细胞经高浓度TWEAK蛋白(100ng/ml)刺激48小时后,Western Blot等方法检测成肌细胞的MHC-I类分子表达情况,以及成肌细胞再生分化、凋亡、自噬等水平。结果显示经TWEAK蛋白刺激后,成肌细胞再生分化、凋亡水平均未发生明显变化；但是,TWEAK蛋白刺激后,成肌细胞MHC-I类分子表达显著上调；并且自噬相关蛋白LC3B和Beclinl表达升高,提示TWEAK刺激后,成肌细胞自噬程度显著增强。二. BAFF作为多发性肌炎和皮肌炎血清生物标记物的临床研究1.多发性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF水平采用定量ELISA法检测41例多发性肌炎、51例皮肌炎患者、25例健康对照血清中BAFF浓度,结果显示多发性肌炎患者(中位数1627.5 pg/ml, range 239.2-19950 pg/ml, P0.001)和皮肌炎患者(中位数1582.5 pg/ml, range 506.5-18360 pg/ml, P0.001)血清BAFF水平均显著高于健康对照(中位数842pg/ml, range 512-1354 pg/ml)。另外,统计结果显示,多发性肌炎患者组和皮肌炎患者组之间血清BAFF水平无显著差异(P0.05)。2.患者血清BAFF水平与临床症状及实验室检查的相关性分析多发性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF浓度与临床表现相关性分析结果显示合并ILD患者组间血清BAFF浓度(49例PM/DM患者,中位数2472 pg/ml, range 497.5-19950 pg/ml)显著高于未合并ILD患者组(43例PM/DM患者,中位数1105 pg/ml, range 239.2-6150pg/ml) (P0.001)。四格表χ2检验结果显示,血清BAFF浓度升高的患者合并ILD的比例显著高于血清BAFF浓度正常的患者(x2 value=20.886, P0.001)。根据患者的其它临床症状如吞咽困难、雷诺现象、技工手、关节炎出现与否进行分组,结果显示组间血清BAFF水平差异均无统计学意义(P值均0.05)。多发性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF浓度与实验室检查相关性分析结果显示ANA阳性患者组血清BAFF浓度(39例患者,中位数1929 pg/ml, range 506.5-19950 pg/ml)显著高于ANA阴性组患者(53例患者,中位数1533pg/ml, range239.2-12865 pg/ml)(P0.05)；抗Jo-1抗体阳性组患者血清BAFF浓度(21例患者,中位数3838pg/ml, range 1385.5-19950 pg/ml)显著高于抗Jo-1抗体阴性组患者(71例患者,中位数1348.5 pg/ml, range 239.2-18360 pg/ml) (P0.001);并且患者的血清BAFF水平与血清抗Jo-1抗体浓度具有显著的统计学相关性(r=0.822,P0.001)。此外,本研究还发现多发性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF水平与血清CK浓度呈显著性正相关(r值分别为0.675,0.723,P均0.01)。对49例多发性肌炎和皮肌炎患者的血清BAFF浓度和淋巴细胞亚群进行相关性分析,结果显示,多发性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF浓度与CD3+T细胞数呈显著性负相关(r=-0.334,P0.05),与CD3+CD4+ T细胞数显著负相关(r=-0.302,P0.05),与CD3+CD8+ T细胞数显著负相关(r=-0.320,P0.05),并且与CD19+CD5- B细胞数显著负相关(r=-0.322,P0.05)。此外,血清BAFF浓度与NK细胞数无统计学相关性(r=0.047,P0.05)。3.患者血清BAFF水平与疾病活动度的相关性分析：横断面研究在收集患者血清标本的同时,采用肌炎活动评估视觉模拟评分(MYOACT)工具对患者的疾病活动度分别进行评分,经Spearman相关性检验分析,结果显示多发性肌炎和皮肌炎患者组血清BAFF浓度都和其MYOACT总疾病活动度评分呈显著正相关(r值分别为0.481、0.536；P均0.01)；并且血清BAFF浓度还与肌肉疾病活动度正相关(r分别为0.257、0.354,P均0.05)。此外,对于皮肌炎患者,我们还发现血清BAFF浓度与皮肤疾病活动度显著相关(r=0.354,P0.05)。4.患者血清BAFF水平与疾病活动度的相关性分析：随访研究随访研究中,我们对24名多发性肌炎和皮肌炎患者进行随访,每名患者的随访次数为2-7次不等,随访时间间隔在6个月至6年不等,每次随访均收集患者的血清标本,同时对患者疾病活动度进行MYOACT评分。其中20名患者被随访了超过2年,并且每名患者随访次数超过3次。对随访研究中收集到的73份血清标本和对应的疾病活动度评分进行相关性分析,我们发现患者血清BAFF浓度和患者MYOACT总疾病活动度评分显著正相关(r=0.68,P0.001),并且和MYOACT肌肉活动度评分同样显著正相关(r=0.533,P0.001)。22名新发病未治疗的患者,经治疗达到缓解期后,随着疾病活动度评分显著下降(P0.001),患者血清BAFF浓度也显著降低(P0.001)；并且治疗前后患者血清BAFF浓度下降值和疾病活动度评分下降值具有显著统计学相关性(r=0.434,P0.05)。总之,本研究结果表明多发性肌炎和皮肌炎患者TWEAK-Fn14表达异常,尤其是在肌肉组织中,TWEAK-Fn14表达显著上调,提示多发性肌炎和皮肌炎骨骼肌组织中浸润的淋巴细胞可能通过表达炎性细胞因子TWEAK,与肌细胞表面高表达的Fn14相互作用,活化下游信号通路,诱导骨骼肌细胞损伤。通过体外实验,我们还证实TWEAK蛋白刺激后,成肌细胞MHC-I类分子和自噬相关蛋白表达显著升高,进一步提示TWEAK-Fn14参与多发性肌炎和皮肌炎的骨骼肌发病机制。本研究还发现多发性肌炎和皮肌炎患者血清BAFF浓度显著升高,并且和自身抗体、肺间质病变显著相关,横断面研究和随访研究显示血清BAFF浓度和肌炎疾病活动度显著相关,提示BAFF是多发性肌炎和皮肌炎疾病活动性评估的潜在血清生物标记物。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.2

【共引文献】