Syk介导的JNK和NLRP3的活化在糖尿病心肌病中的作用的研究

发布时间：2019-02-13 07:18

【摘要】：目的糖尿病(diabetes mellitus,DM)是以高血糖、高血脂为特征的代谢性疾病,糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是继发于DM患者的常见并发症,其危害极大,已成为DM患者死亡的首要病因。早期表现为舒张功能降低,心肌顺应能力下降、舒张期充盈受限,晚期为收缩功能降低,易导致心衰。DCM的发病机制尚未完全阐明。脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)或c-Jun氨基末端激酶(JNK)可调节免疫应答,已有实验证实,Syk或JNK抑制剂均可引起巨噬细胞中NLRP3的活性下降。而且在高糖诱导的H9c2心肌细胞中p-JNK、NLRP3的表达升高,在高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞中p-Syk的表达升高,表明p-Syk、p-JNK和NLRP3与DM的致病机制相关。但在DCM炎症损伤中Syk是否发挥作用以及与JNK和NLRP3的作用关系迄今还没有报道。因此,文章通过体内实验检测了1型糖尿病SD大鼠和正常对照SD大鼠心肌组织中Syk、JNK及NLRP3的表达,通过体外实验研究高糖诱导的乳鼠原代心肌细胞和大鼠H9c2心肌细胞中Syk、JNK及NLRP3炎症小体之间的作用机制,为治疗DCM提供了新的依据。方法1.构建糖尿病大鼠动物模型:将SD大鼠随机分为Ctrl组和DCM组。DCM组大鼠一次性腹腔注射65 mg/kg STZ溶液(1%STZ),而Ctrl组大鼠以相同的方式注射同等量的柠檬酸溶液(PH 4.2)。3天后测量并记录实验大鼠的血糖及体重,若血糖浓度16.7 mmol/L为糖尿病模型;超声心动图和血流动力学监测Ctrl组和DCM组大鼠的心脏功能改变;两组大鼠心肌组织进行HE(Hematoxylin-eosin)和马松(Masson)染色,光镜下观察心肌组织构造的病理改变。2.Western Blot方法检测造模后第16周的DCM组大鼠和Ctrl组大鼠心肌中p-Syk、p-JNK及NLRP3的蛋白水平。3.H9c2细胞株的分组情况:Ctrl组(正常糖浓度5.5 mmol/L处理)、HG处理组(高糖浓度25 mmol/L处理)、抑制剂对照组(Syk抑制剂BAY61-3606浓度1μmol/L处理2 h,或JNK抑制剂SP浓度20μmol/L处理1 h,然后正常糖浓度5.5 mmol/L处理)以及抑制剂实验组(Syk抑制剂BAY61-3606浓度1μmol/L处理2 h,或JNK抑制剂SP浓度20μmol/L处理1 h,然后高糖浓度25 mmol/L处理),RT-PCR实验检测加入BAY61-3606或SP抑制剂后NLRP3、Caspase-1和IL-1β的m RNA的表达水平;Western Blot实验检测BAY61-3606或SP抑制剂处理后NLRP3的蛋白水平变化。4.新生乳鼠心肌细胞分组情况:Ctrl组(正常糖浓度5.5 mmol/L处理)、HG处理组(高糖浓度25 mmol/L处理)、抑制剂对照组(Syk抑制剂BAY61-3606浓度1μmol/L处理2 h,或JNK抑制剂SP浓度20μmol/L处理1 h,然后正常糖浓度5.5 mmol/L处理)以及抑制剂实验组(Syk抑制剂BAY61-3606浓度1μmol/L处理2 h,或JNK抑制剂SP浓度20μmol/L处理1 h,然后高糖浓度25 mmol/L处理),RT-PCR实验检测加入BAY61-3606或SP抑制剂后NLRP3、Caspase-1和IL-1β的m RNA的表达水平;Western Blot实验检测BAY61-3606或SP抑制剂处理后NLRP3的蛋白水平变化。5.小干扰RNA对H9c2细胞中Syk基因进行干扰,然后用RT-PCR方法和Real-Time PCR实验方法测定干扰序列的干扰效率;Western Blot实验检测Syk-si RNA转染后NLRP3的蛋白水平变化;Real-Time PCR实验检测Syk-si RNA处理后NLRP3、Caspase-1和IL-1β的m RNA表达水平。6.Western Blot实验测定Syk-si RNA或BAY61-3606处理后大鼠H9c2细胞株中p-JNK的蛋白水平变化。7.Western Blot实验测定Syk抑制剂BAY61-3606处理后乳鼠心肌细胞中p-JNK的蛋白水平变化。结果1.一次性腹腔注射大剂量STZ后,DCM组可见“三多一少”症候,且精力不振,毛发干燥,严重者可见白内障现象,Ctrl组大鼠精力良好,运动敏捷。DCM组随机血糖浓度明显高于Ctrl组(P0.01),且体重明显下降(P0.01);STZ注射第12周发现,两组大鼠左心室功能出现明显不同,DCM组大鼠E/A比值、FS和EF均显著低于Ctrl组大鼠(P0.05);HE结果表明,DCM组大鼠与Ctrl组相比部分心肌细胞体积明显增大,心肌肌纤维走向杂乱,炎性细胞大量浸润。Masson结果表明,DCM组大鼠与Ctrl组相比心肌间质及血管周围胶原成分大量累积,纤维化严重。以上结果均表明SD大鼠1型糖尿病心肌病动物模型构建成功。2.大鼠心脏组织Western Blot方法结果显示,DCM组大鼠心肌组织中p-Syk、p-JNK、NLRP3蛋白表达水平明显升高。3.RT-PCR结果表明,在大鼠H9c2细胞株中,BAY61-3606或SP抑制剂显著减轻高糖引起的NLRP3、Caspase-1和IL-1β的m RNA表达量(P0.05);Western Blot实验显示,BAY61-3606或SP预处理显著阻碍了NLRP3的蛋白水平,且差异具有统计学意义(P0.05)。4.RT-PCR结果表明,在乳鼠原代心肌细胞中,BAY61-3606或SP抑制剂显著减轻高糖引起的NLRP3、Caspase-1和IL-1β的m RNA表达量(P0.05);Western Blot结果表明,BAY61-3606或SP预处理显著阻滞了NLRP3的蛋白表达,且差异具有统计学意义(P0.05)。5.RT-PCR和Real-Time PCR结果表明,Syk-si RNA可显著沉默Syk的表达(P0.05);Western Blot结果显示,Syk-si RNA干扰显著阻碍了NLRP3的蛋白量,且差异具有统计学意义(P0.05);Real-Time PCR定量结果表明,Syk-si RNA干扰抑制了NLRP3、Caspase-1和IL-1β的m RNA表达,且差异具有统计学意义(P0.05)。6.Western Blot结果表明,与NC-si RNA组对比,Syk-si RNA干扰明显抑制了H9c2细胞中p-JNK的蛋白表达(P0.05)。7.Western Blot结果表明,BAY61-3606预处理明显抑制了H9c2细胞株中p-JNK的蛋白水平,在乳鼠原代心肌细胞中亦得到相似的结果,且差异具有统计学意义(P0.05)。结论综上所述,本实验成功地构建了SD大鼠1型DCM动物模型,而且p-Syk、p-JNK及NLRP3的蛋白水平在糖尿病大鼠心脏组织中显著升高。p-Syk、p-JNK、NLRP3炎症小体和IL-1β与DCM的发病机制密切相关。Syk介导的JNK和NLRP3的活化这一途径参与了DCM致病过程。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2;R542.2

【参考文献】