脂联素对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞迁移及侵袭特性影响的研究

发布时间：2019-02-20 21:14

【摘要】：实验目的大量研究证实血浆中含量最高的脂肪因子脂联素(Adiponectin,AD)参与类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)的发病过程。我们前期工作证实RA患者滑膜组织中AD及Adipo R1表达明显高于正常人群;而关节局部高表达的脂联素可加重胶原诱导关节炎小鼠(Collagen-induced arthritis,CIA)的骨破坏,其机制尚不十分清楚。RA滑膜成纤维细胞(Rheumatoid arthritis synovial fibroblasts,RASFs)与OA滑膜成纤维细胞或皮肤的成纤维细胞有着迥然不同的特性,表现为异常增生能力、介导炎症稽留、迁移及侵袭等类肿瘤特性。其中,RASFs独特的迁移和侵袭特性在RA骨侵蚀中起着至关重要的作用。因此本研究主要探讨AD是否通过影响RASFs迁移性及侵袭性等类肿瘤生物学特性,介导RA炎症及骨侵蚀病理过程。1.AD对RASFs迁移及侵袭特性的影响体内实验:构建胶原诱导关节炎(CIA)小鼠模型,小鼠关节局部注射脂联素,观察AD对CIA鼠关节炎症及骨侵袭的影响。体外实验:细胞划痕实验及Transwell corning实验观察不同浓度AD(0、0.1、1和10μg/ml)与RASFs培养24h后对RASFs迁移的影响。用覆盖明胶的Transwell corning实验观察不同浓度AD(0、0.1、1和10μg/ml)与RASFs培养24h后对RASFs的侵袭作用。将AD受体(Adiponectin receptors,Adipo Rs)沉默后,观察AD对RASFs的迁移及侵袭特性的影响是否依赖Adipo Rs。2.AD对RASFs基质金属蛋白酶(MMP)2,9表达的影响体内实验:观察CIA小鼠关节局部滑膜组织中AD m RNA表达与MMP-2,MMP-9m RNA表达的相关性;观察CIA小鼠关节局部注射AD后对关节组织中MMP-2,MMP-9表达的影响。体外实验:Real-time PCR方法及Western blot方法检测AD是对RASFs中MMP-2,MMP-9表达的影响。观察沉默Adipo Rs后,AD对RASFs中MMP-2,MMP-9表达的影响。3.AD对RASFs内PI3K/AKT信号通路的影响PI3K/AKT信号通路与细胞迁移、粘附、血管生成及细胞外基质降解密切相关。用10μg/ml AD在不同时间点(0min、5min、10min、15min、30min、60min)刺激RASFs,收取细胞,提蛋白,采用western blot方法检测RASFs中PI3K、AKT磷酸化情况的变化。实验结果1.AD通过Adipo R1促进RASFs迁移性及侵袭性体内实验:与CIA组鼠相比,CIA小鼠关节局部注射AD后,滑膜炎症、滑膜增生及骨侵蚀明显增加。体外实验:AD(10μg/ml)组较空白组显著促进RASFs迁移通过Transwell小室微孔的数目(234.3±69.1 Vs 127.3±42.5),且具有统计学差异(P0.05);Adipo R1沉默后,RASFs迁移(137.3±14.3 Vs 94±0.9)及侵袭(151.9±28.6 Vs108.3±26.3)通过Transwell小室微孔的数目明显减少,具有统计学差异(P0.05)。沉默Adipo R2,RASFs迁移数与未沉默组无明显差异。2.AD通过AdipoR1促进RASFs中MMP-2,MMP-9表达体内实验:CIA小鼠关节滑膜组织中MMP-2、MMP-9 m RNA表达较正常小鼠组明显增加;且MMP-2和MMP-9 m RNA表达与AD m RNA表达成正相关(相关系数分别为r=0.6723,0.4569,显著性p0.05)。与未注射组相比,CIA组小鼠关节局部注射AD后,关节组织中MMP-2、MMP-9的表达明显增高。体外实验:AD(10μg/ml)组较空白组显著促进RASFs表达MMP-2(12.11±4.28 Vs 2.19±1.32,P0.05)及MMP-9(26.12±13.74 Vs 2.80±2.30,P0.05).沉默Adipo Rs后,Adipo R1干扰组较空白载体干扰组(Negative Control,NC)组MMP-2(1.78±0.48 Vs 4.27±2.45),MMP-9(2.66±1.83 Vs 11.25±7.88)表达显著下降且具有统计学差异(P0.05)。Adipo R2干扰组较空白载体干扰组MMP-2(4.14±2.17 Vs 4.27±4.25),MMP-9(5.26±2.80 Vs 11.25±7.88)表达下调,但无明显统计学差异。2.AD对RASFs内PI3K/AKT信号通路AD刺激RASFs30min后,胞内PI3K在开始进行磷酸化持续至60min。其中,AKT308位点在15min开始磷酸化,30min达到磷酸化高峰;473位点在30min开始进行磷酸化持续至60min。实验结论1.AD可促进RASF迁移及侵袭特性,可能是其加重RA骨侵蚀,参与RA病理过程的重要机制之一。2.AD可促进RASF迁移及侵袭作用相关因子MMP-2,MMP-9表达3.AD通过Adipo R1影响RASF迁移性、侵袭特性及MMP-2,MMP-9表达。4.AD促进RASFs PI3K/AKT信号通路的磷酸化,可能是影响RASFs的迁移及侵袭特性的主要胞内信号通路。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.22

【参考文献】

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1 谈文峰;王芳;张缪佳;刘晓华;郭敦明;朱晓敏;张海地;;运用基因芯片初步研究类风湿关节炎患者外周血单个核细胞基因表达谱特征[J];中华风湿病学杂志;2006年12期

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本文编号：2427277