胰岛素及胰岛素受体信号通路在氟骨症发病机制中的作用

发布时间：2019-04-16 17:17

【摘要】：目的：最近的研究证明了成骨细胞分泌的不同形式的骨钙素在骨骼与胰岛交联作用中的地位，使得骨骼与胰腺之间相互调控和作用越来越受到关注，因此胰岛素在代谢性骨病发病机制中的地位再次成为热点。我们以往的研究已经明确了代谢性骨病之一的氟骨症主要在氟骨症发病过程中成骨细胞和破骨细胞表现出程度不同的活跃。成骨细胞功能活跃在氟骨症病变中是一个起主导作用的环节。该课题的主要目的是考察氟骨症这些特征性改变与胰岛素对骨转换的调控是否联系，并阐明胰岛素在氟中毒诱导的骨病变以及体外染氟成骨细胞的刺激作用的地位。方法及结果：采用灌胃给氟2月复制氟骨症模型，并在染氟1月后经腹腔注射一次STZ来抑制胰岛素的分泌。结果显示投氟大鼠氟斑牙特征明显，而且随着投氟剂量的升高，氟斑牙由半透明出现条纹到牙齿呈白垩色；而且STZ联合氟处理组大鼠牙齿破环较相同投氟组明显，尤其是高氟出现了牙齿缺损和断裂。利用生化方法分析的胰岛素、胰岛素敏感性、血糖和HbA1C水平，结果表明了投氟明显刺激了胰岛素的分泌，相应地血糖和HbA1C水平变化不明显。联合STZ处理组大鼠的胰岛素在低氟组是升高的，高氟组未观察到降低；然而STZ处理大鼠明显影响了胰岛素的降糖功能。胰岛素敏感实验反应了机体的胰岛素效能，从血糖的变化趋势可见投低剂量氟和联合STZ处理引起的血糖回归正常延时很可能归于一定剂量的氟能降低胰岛素的敏感性甚至引起胰岛素抵抗发生。采用免疫组化检测胰岛内胰岛素和骨钙素受体GPRC6A蛋白表达情况，发现投氟刺激了胰岛素的分泌，而且高氟组大鼠的胰岛素分泌能力提高更显著。单独STZ处理抑制了胰岛素分泌，联合氟处理大鼠后仍然刺激了胰岛素的表达。进一步骨密度和骨钙素水平的分析显示了随着投氟量的增加，骨密度下降更明显；STZ处理加重了骨密度的下降，且投氟越高骨密度下降越明显。单独氟处理大鼠轻度诱导了GPRC6A的蛋白表达，而联合STZ处理后投氟反而引起了该受体的表达下降。骨钙素仅在给予高氟条件下轻度升高，联合应用STZ处理组后各投氟组间骨钙素变化不显著。鉴于OCN与GPRC6A之间的关系，可见氟能够轻度刺激GPRC6A表达和提高血液中的骨钙素含量。联系前面观察到的氟明显刺激胰岛素的分泌；同时，STZ及联合氟作用降低了胰岛素的敏感性，影响GPRC6A在胰岛内的表达导致其下降。利用定量PCR技术分析了投氟或联合STZ处理组大鼠成骨、破骨标志及相关调控基因的变化。结果显示出低量氟明显诱导成骨细胞早期分化，高剂量氟对诱导分化作用不明显。STZ联合投氟处理明显抑制了成骨早期分化，但对成骨晚期分化有一定作用。投氟显著刺激了破骨细胞的功能，STZ降低了破骨细胞的功能，而且联合投氟破骨作用不明显。破骨调控因子的变化显示了投氟显著刺激了破骨和骨吸收。STZ处理并没有明显抑制破骨相关基因的表达，但是联合投氟显著促进OPG表达和降低RANKL基因，说明了两者联合应用抑制了破骨活性。TGFβ、β-catenin和Wnt10的基因变化说明了TGFβ在氟诱导成骨和破骨过程中起到重要作用，而且在STZ诱导的胰岛素敏感性下降而导致氟诱导成骨晚期分化和破骨过程中起到一定作用。而β-catenin和Wnt10主要参与了氟作用下引起成骨、破骨活性改变，，STZ联合氟处理一定程度抑制了大鼠骨组织β-catenin的表达，主要体现了成骨受抑制而引起其表达。利用出生三周的Wistar小鼠股骨和胫骨收集骨髓间充质干细胞进行成骨细胞分化实验观察。选取稳定和细胞种类纯化的第三代的BMSC，矿化液孵育28天后茜素红S染色，观察到细胞出现融合和多层细胞叠加呈紫色或粉色的团块,说明了本实验收集的BMSC传至第三代后主要是由成骨潜能的干细胞组成,从而为下面的成骨诱导实验提供依据。染氟或胰岛素处理细胞能够刺激BMSC活性，而且胰岛素联合在低、中剂量氟作用下加强了细胞活性，但是胰岛素联合高剂量氟加重抑制了细胞活性，体现了胰岛素对成骨增生作用与氟刺激成骨作用一致。通过改良钙-钴法进行碱性磷酸酶染色，观察分化细胞早期情况。低、中剂量染氟明显刺激了BMSC细胞早期分化，但是高量氟显著抑制了该细胞的分化；联合胰岛素处理BMSC细胞也是呈现低、中剂量氟的刺激作用和高剂量氟对细胞早期成骨分化的抑制作用，这种协同作用主要体现在高剂量氟对ALP的抑制作用。利用MC3T3-E1细胞作为体外成骨细胞前体染氟模型。通过不同剂量氟和胰岛素对该细胞增殖活性的影响，确定了能够诱导成骨细胞活性的染氟浓度1、2、8mgF-/L和50nmmol/L为细胞实验条件。为了观察胰岛素受体对染氟成骨细胞的诱导成骨和破骨活性的影响，我们采用基因干扰（siRNA）有效降低了胰岛素受体在成骨细胞内的表达。采用CCK-8方法观察了从低到高剂量氟联合胰岛素作用对成骨细胞活性的影响。结果显示出染氟对MC3T3-E1细胞活性的影响主要集中在低和中剂量氟处理组，胰岛素不仅本身刺激成骨细胞活性，而且能够加强氟刺激成骨细胞活性的作用。定量聚合酶链式反应分析了成骨细胞内胰岛素受体底物及与骨钙素调控胰岛素分泌密切相关因子Esp和FoxO1，结果显示出胰岛素受体有效抑制后，明显降低了胰岛素受体底物，但显著激发了Esp基因的表达；联合染氟后不同程度地诱导了胰岛素受体的基因表达和激活胰岛素受体底物的表达，相应地降低了Esp基因。说明了氟能够显著刺激胰岛素受体的表达并通过胰岛素受体底物和Esp基因信号通路相互协调发挥其调控成骨细胞的作用。进一步定量分析了染氟成骨细胞内成骨和破骨调控因子在胰岛素受体表达受抑制后的表达变化。胰岛素受体主要影响成骨转录因子osterix和骨钙素发挥刺激成骨作用，而MAPK信号通路参与胰岛素调控的成骨活性过程。另一方面，破骨细胞分化调控因子的变化说明了胰岛素受体主要通过调控OPG基因的表达变化发挥调控破骨细胞分化作用。结论: 通过体内外实验结果我们发现氟斑牙病变程度随着投氟量的增加而加重，链尿佐菌素抑制胰岛素分泌加重氟中毒症状。氟能够轻度刺激GPRC6A表达和提高血液中的骨钙素含量，明显刺激胰腺分泌胰岛素作用。不同浓度氟作用大鼠可引起胰岛素敏感性的变化。链尿佐菌素（STZ）抑制大鼠胰岛素降糖效应，同时也导致胰岛素敏感性下降引起胰岛素抵抗,造成机体各器官对胰岛素调控作用不敏感。投氟诱导大鼠骨密度下降，且投氟越高骨密度下降。联合成骨和破骨标志物和基因的变化，说明了给氟激发了大鼠股骨活跃的骨转换。大鼠胰岛素活性和敏感性下降明显影响了成骨细胞和破骨细胞分化和进一步加重骨病变。TGFβ在氟诱导成骨和破骨过程中起到重要作用，而且参与了胰岛素对氟诱导的骨转换发生调控机制。氟通过调控β-catenin和Wnt10途径发挥调控成骨、破骨活性作用。体外实验验证了一定剂量氟刺激骨髓间充质细胞和成骨前体细胞的增生和诱导骨髓间质干细胞分化；胰岛素刺激两种细胞细胞增生，但诱导成骨细胞早期分化作用不明显。胰岛素主要通过胰岛素受体介导胰岛素受体底物和Esp基因参与氟诱导的成骨和破骨活性变化。胰岛素主要影响了成骨分化后期osterix和骨钙素的表达来参与氟诱导的成骨作用；同样地，它也是主要通过对OPG的表达来参与氟诱导的破骨作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R599.1

【参考文献】