Mibefradil对INS-1细胞糖毒性保护作用的初步研究

发布时间：2019-04-22 13:09

【摘要】：研究背景2型糖尿病是胰岛β细胞的功能障碍和外周组织的胰岛素抵抗为主要特征的一类代谢性疾病。长期高血糖对胰岛细胞的胰岛素合成、分泌以及存活等均产生不利的影响,其中涉及多种机制,包括体内钙离子平衡的破坏[1]。钙离子平衡的紊乱对胰岛β细胞生长/功能和胰岛素分泌信号通路均会产生抑制作用[2]。Mibefradil作为选择性T型钙通道拮抗剂,对T型钙离子通道的阻滞效应约为其对L型钙离子通道阻滞效应的30-100倍,最早作为抗心绞痛、降压药物应用于临床,目前该药物广泛用于肿瘤、疼痛、癫痫等方面的研究,在糖尿病方面研究尚不深入。T型钙通道是低电压激活钙离子通道,该通道仅需一个较低的电压(约-70mv)即可被激活,因此是唯一一类允许钙离子在膜静息电位内流的通道[3]。本课题组既往研究发现T型钙通道在db/db小鼠(2型糖尿病模型小鼠,瘦素受体自发突变导致极度肥胖、多食、消渴、多尿等)肝脏、脑组织中表达明显高于野生型小鼠,Mibefradil可明显降低db/db小鼠的血糖及血脂水平,但对正常小鼠则无明显作用[4]。迄今为止,T型钙通道特别是Mibefradil在胰岛β细胞中的作用仍不清楚。因此本研究拟将高糖培养大鼠胰岛素瘤细胞株(INS-1)作为研究对象,高糖培养细胞构建细胞高糖模型,Mibefradil干预INS-1细胞,采用NNC 55-0396(NNC,仅拮抗T型钙离子通道)、尼卡地平(Nic,仅拮抗L型钙离子通道)作为对照药物,观察药物对INS-1细胞凋亡、胰岛素分泌的作用,在此基础上进一步观察其对INS-1细胞T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基表达的作用,以期初步探讨Mibefradil对INS-1细胞功能的作用及其可能的机制。方法:本课题将INS-1细胞作为研究对象,利用CCK-8法检测细胞增殖确定最佳高糖及药物(Mibefradil、NNC 55-0396、尼卡地平)作用浓度及时间后,高浓度葡萄糖(33.3mmol/L)处理细胞构建细胞高糖模型。将细胞分为正常培养组、高糖组、药物组、高糖+药物组,流式细胞技术检测细胞凋亡、放射免疫法检测细胞胰岛素分泌,以观察药物对INS-1细胞凋亡及胰岛素分泌的作用,RT-PCR、Western-Blot检测T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基基因及蛋白表达观察药物对其表达的作用。主要结果:1.较正常培养组,33.3mmol/L葡萄糖孵育细胞72h时,显著抑制细胞增殖(P0.05);1μmol/L Mibefradil、1μmol/L NNC 55-0396、10μmol/L尼卡地平作用24小时对细胞增殖无明显抑制(P0.05),在此基础上增加药物浓度或延长作用时间均可显著抑制细胞增殖(P0.05)。2.较正常培养组,高糖组细胞凋亡明显增加(P0.05);较高糖培养组,高糖+Mibefraidl组、高糖+NNC 55-0396组、高糖+尼卡地平组以及高糖+NNC 55-0396+尼卡地平组细胞凋亡无显著差异(P0.05)。3.较正常培养组,药物组细胞基础胰岛素分泌(3.3mmol/L葡萄糖刺激)及葡萄糖刺激胰岛素分泌(16.7mmol/L葡萄糖刺激)均无显著差异(P0.05)。较高糖组,只有高糖+Mibefradil组显著降低细胞胰岛素分泌(基础分泌以及葡萄糖刺激胰岛素分泌)(P0.05)。4.1)高糖(33.3mmol/L)作用于INS-1细胞72小时显著升高cav3.1、cav3.2亚基基因及蛋白表达(P0.05)。2)与正常培养组相比,Mibefradil组T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基的基因及蛋白表达无显著差异(P0.05);而与高糖培养组相比,高糖+Mibefrail组显著降低T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基的基因及蛋白表达(P0.05)。主要结论:1.本实验中Mibefradil、NNC 55-0396、尼卡地平对高糖诱导的INS-1细胞凋亡无明显保护作用。2.Mibefradil可显著抑制高糖作用下INS-1细胞胰岛素分泌,同时对正常培养的INS-1细胞无此作用;3.高糖可增加INS-1细胞中T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基基因及蛋白表达;4.Mibefradil可显著抑制高糖培养下INS-1细胞T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基的基因及蛋白表达,而对正常培养的INS-1细胞无明显作用。上述结果提示Mibefradil对正常培养下INS-1细胞胰岛素分泌以及cav3.1、cav3.2亚基基因及蛋白表达均无明显作用,仅降低高糖培养下INS-1细胞胰岛素分泌、T型钙通道cav3.1、cav3.2亚基表达,提示Mibefraidl可能通过拮抗T型钙通道抑制高糖作用下INS-1细胞胰岛素分泌,为深入研究T型钙通道及Mibefradil在2型糖尿病发生发展过程中的作用提供基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1

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本文编号：2462864