MiR-9通过抑制糖异生水平与青蒿琥酯通过SIRT1保护胰岛细胞免受细胞因子损伤缓解糖尿病的分子机制研究

发布时间：2019-04-26 20:45

【摘要】：糖尿病根据其发生机制以及临床表现不同可分为1型和2型,1型主要发病年龄在30岁以下,以青少年居多,发病急,常出现酮症酸中毒。1型糖尿病又称为胰岛素依赖型糖尿病,是指需要长期不间断补充外源性胰岛素而维持机体代谢需要。此型糖尿病多数由于机体本身胰岛细胞因炎症、病毒、高血糖或者自身免疫等导致胰岛细胞死亡、胰岛细胞数目减少,胰岛素分泌绝对不足引起。所以此型糖尿病若能保护胰岛细胞的受损,则可缓解糖尿病症状。2型糖尿病又称为非胰岛素依赖型糖尿病,其发病年龄多在40岁以后,尤以中老年人居多,发病慢。此型病人血浆胰岛素水平可正常甚至高于正常,多出现胰岛素抵抗,外周组织对葡萄糖利用率减低,引起高血糖。机体血糖的平衡得益于维持血糖的产生和利用间处于动态平衡状态。肝脏是糖代谢的重要器官,尤其在饥饿条件下,肝糖异生成为血糖的主要来源,但是糖异生的过度激活是构成引起血糖异常升高的主要因素之一。而胰腺β细胞分泌胰岛素促进机体正常生理情况下外周组织对糖的利用,在维持血糖平衡中占据着重要的地位。因此无论这两个方面中的任何一个方面出现功能障碍均可导致糖代谢紊乱,或是糖的产生增多,或是糖的利用减少,引起血糖升高,导致糖尿病的发生。肝脏糖异生是在饥饿条件下被强烈激活,增加肝糖输出(HGP)以满足机体对葡萄糖需求的肝脏糖代谢过程。在糖尿病小鼠模型中糖异生水平也异常活跃。而大量研究表明叉头转录因子1(FoxO1)在饥饿小鼠模型以及糖尿病小鼠模型中高表达。而在糖皮质激素地塞米松以及腺苷酸环化酶激活剂毛喉素(Forskolin)诱导下的正常小鼠肝细胞系TAMH中FoxO1也高表达,同时激活一系列包括磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)等糖异生关键酶的高表达,引起糖异生水平增高,导致HGP增加。研究表明肿瘤及糖代谢紊乱可导致包括miR-9、miR-29等多种微小RNA(miRNA)表达谱的改变,从而通过它们对靶基因的调控,加剧代谢紊乱及肿瘤发生。大量研究表明叉头转录因子(foxo)家族是mirna调控的靶点。同时在子宫内膜癌中,高表达的mir-9抑制了肿瘤抑制因子foxo1的表达,进而引发一系列病生理的改变,促进肿瘤的发生发展。另外研究发现mir-29在糖尿病小鼠中高表达,而它却能在饥饿情况下抑制糖异生关键酶g6pase以及转录共激活子pgc-1α的表达,从而下调空腹血糖水平。那么在代谢紊乱的机体中异常表达的mir-9是否与高表达的转录因子foxo1之间存在一定的调控关系,其机制不清楚。本课题第一部分应用禁食小鼠模型、肥胖小鼠模型、糖尿病小鼠模型以及正常小鼠肝脏细胞系tamh细胞进行研究,分别检测了小鼠肝脏组织以及tamh细胞中相关基因的蛋白表达水平以及相关rna、mir-9的表达水平,并对转录因子foxo1及其下游基因pepck、g6pase的表达水平进行检测,结果发现禁食正常小鼠肝脏转录因子foxo1及其下游基因pepck、g6pase的表达水平是明显升高的,这与之前大量相关文献报道一致。而mir-9的表达相对于正常喂食小鼠明显降低,而肥胖小鼠与糖尿病小鼠的mir-9表达也明显降低。而用腺病毒过表达mir-9的肥胖小鼠能缓解肥胖小鼠的糖耐量受损并增强胰岛素敏感性;同时我们在tamh细胞中转染mir-9mimic后,发现foxo1的mrna及蛋白表达均明显降低,而转染mir-9inhibitor却得到相反的结果;用计算机软件预测mir-9在foxo13’非翻译区(utr)区域结合位点序列,荧光素酶报告基因实验证明mir-9在foxo13’utr区域有结合并能对foxo1发挥抑制性调节作用。因此研究结果证明mir-9靶向抑制性调控foxo1的表达,从而下调糖异生关键基因pepck、g6pase,进而抑制肝糖异生水平,降低hgp。同时我们在tamh细胞中过表达mir-9后,在forskolin诱导下模拟饥饿状态,发现foxo1蛋白表达与对照组相比明显下调,同时糖异生关键酶pepck、g6pase的表达水平也明显下降,且细胞上清中糖输出水平也有明显下降。胰岛素通过一系列信号通路促进外周组织对葡萄糖的利用,是机体内唯一降低血糖的激素;同时胰岛素是合成代谢激素,可促进糖原、脂肪、蛋白质的合成,促进葡萄糖向其他能源或结构物质的转化,促进糖的代谢去路。胰岛素由胰腺β细胞分泌,其分泌调节受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等调节。而胰腺β细胞的损伤和凋亡被认为是引起胰岛素分泌绝对量不足的主要原因,其损伤因子为多方面,如病毒、自身免疫、高糖、棕榈酸以及致炎因子等。在这些调节介质中,白介素(IL)-1β对β细胞的损伤受到越来越大的关注。青蒿琥酯(Artesunate ART)是从传统中药中分离出的青蒿素衍生物,具有抗病毒、抗炎以及抗癌作用,多年来被认为是治疗疟疾最有效和安全的试剂,但是到目前为止关于它在糖尿病中的作用很少有报道。本课题第二部分目的是探究青蒿琥酯是否可以保护胰腺β细胞免受细胞因子IL-1β诱导的损伤。课题用Griess Assay盒检测一氧化氮(NO)的产生。Western blot检测SIRT1以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达。荧光素酶报告基因实验检测NF-kB的转录活性,RNA干扰法沉默Sirt1的表达。葡萄糖刺激胰岛素分泌实验(GSIS)用于检测ART对胰岛细胞的保护作用。MTT实验和Hochest/PI双染实验分别用于检测ART对胰岛细胞的活力和凋亡作用。实验结果发现ART逆转了因IL-1β诱导的胰腺β细胞损伤,且ART抑制了IL-1β诱导的核因子(NF)-kB信号通路的激活以及iNOS的表达与NO的产生;同时发现ART逆转了INS-1细胞以及胰岛中IL-1β诱导的SIRT1蛋白表达的下降,我们也进一步用干扰小RNA(siRNA)以及基因敲除的方法发现和证明了抑制SIRT1的作用可部分消除ART对胰腺β细胞的保护作用以及在IL-1β处理的胰腺β细胞中SIRT1参与了ART对NF-kB信号通路的作用过程。即而得出结论:ART对胰腺β细胞的保护作用是通过激活SIRT1蛋白表达,并利用SIRT1抑制NF-kB信号通路的作用而实现的。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1

【参考文献】