BCL-2转染的ADSCs结合3D胶原支架促进糖尿病小鼠溃疡愈合的研究

发布时间：2019-04-27 01:00

【摘要】：目的糖尿病是临床上的常见病及多发病,其中有5-10%的糖尿病患者发生肢体末端的皮肤溃疡。糖尿病溃疡主要是由局部缺血、局部神经性病变所引起。目前糖尿病溃疡已经成为最常见的非创伤性截肢的原因。近年来,生长因子疗法以及干细胞,如骨髓来源单核细胞、脂肪来源干细胞、内皮祖细胞的应用在慢性难愈性创面的治疗中研究众多,均有利于增加创面局部新生血管形成,促进成纤维细胞增殖,从而促进创面愈合。与其他干细胞相比,脂肪来源干细胞具有很多优势,原因在于脂肪组织作为整形外科的副产物,来源丰富,取材方便,对供区部位不会造成太大的损伤,且脂肪组织中干细胞含量丰富。目前在糖尿病溃疡治疗的研究中,外源性的生长因子和细胞移植的应用存在一定困难,主要表现在两个方面：其一,由于创面的渗液对细胞及生长因子具有冲刷作用,导致移植后细胞的存活率较低；其二,生长因子作用时间不长,且应用单一生长因子的疗效也非常有限。利用具有生物活性的人工移植物修复皮肤缺损近年来受到广‘泛关注。胶原是属于细胞外基质的一种结构蛋白质,广泛的存在于皮肤组织中,在皮肤的修复过程中具有十分重要的作用。由于其良好的生物相容性,适宜的可降解性,以及弱抗原性等特性,适合制成各种生物支架材料。在组织工程学中,胶原支架材料被广泛运用于组织再生和修复。在前期研究中,本课题组从小牛筋膜中提取胶原材料制成CBD-VEGF的3D胶原支架通过大鼠糖尿病模型的体内实验,证实其材料具有良好的细胞粘附性,能很好地支持细胞迁移并促进肉芽组织的形成,有效的将外源性VEGF锁定于创面局部,并缓慢释放。ADSCs无论通过何种机制促进创面愈合,都离不开ADSCs的分化功能和旁分泌作用,如果移植后ADSCs的成活数量不足,ADSCs的分化功能和旁分泌功能都失去了基础,就不会有高效率愈合。BCL-2基因是抗凋亡基因,有学者用BCL-2转染骨髓间充质干细胞抑制凋亡,发现在体外缺氧环境下BCL-2使骨髓间充质干细胞凋亡减少了32%,血管内皮细胞生长因子分泌增加了60%,体内动物实验表明转染BCL-2的骨髓间充质干细胞成活率提高了1.2-2.2倍,并改善梗死心肌的功能,本课题以前期胶原绑定VEGF(CBD-VEGF)治疗糖尿病大鼠溃疡创面研究结果为基础,尝试转染BCL-2的ADSCs结合3D胶原支架合成完整的促进创面愈合的生物支架体系,检测其生物活性,并全面评估该生物支架体系；同时,构建小鼠的1型糖尿病溃疡模型,在实验动物体内评价ADSCs/3D胶原生物支架体系的治疗效果,从而为糖尿病溃疡的治疗带来新的希望。材料与方法材料：从小牛筋膜中提取Ⅰ型胶原蛋白,使用冻干技术将其制成多孔疏松的胶原膜片,裁剪成直径大小7mm的圆形,厚度1.0mm备用。扫描电镜观察胶原膜片形态、三维结构及孔隙大小。实验方法体外实验1.实验所用脂肪组织取自南京大学附属南京鼓楼医院整形外科1名行腹部脂肪抽吸术手术患者,健康男性,35岁。无菌条件下取脂肪组织100ml,1h内将脂肪组织送至实验室,在超净台中将脂肪组织在PBS液中漂洗3次,尽量去除结缔组织及血管内皮,将脂肪颗粒,加入0.1%的Ⅰ型胶原酶,置于摇床上,在37℃,以200次/分钟震荡消化1h,取出脂肪以离心力500g离心5min,将细胞成分与脂肪组织和纤维组织分离,用完全培养基重悬细胞成分,200μm滤筛过滤,将滤液以300g离心力离心5min,去除上清,用完全培养基重悬细胞,将细胞接种到25cm2的培养瓶中,放入37℃,5%CO2培养箱中培养。接种24h后换液,以后每3d换液一次,24h细胞开始贴壁,7～10d细胞生长至80%融合时,定义为0代,用0.25%trypsin/EDTA消化,完全培养基终止消化,1：2传代培养。2.采用免疫荧光法标记,用流式细胞仪检测干细胞表型抗原CD29、CD44、CD90;造血干细胞抗原标志CD34和CD133；成纤维细胞抗原标志HLA-DR。3.构建表达Bcl-2的腺病毒载体(Ad/Bcl-2)和表达EGFP的腺病毒载体(Ad/EGFP),先以Ad/EGFP按不同感染复数(multiplicities of infection, MOI)值转染ADSCs,荧光显微镜下观察EGFP转染效率,并用流式细胞仪检测,确定最佳的MOI值,用此值行Bcl-2基因转染。4.采用Western Blot实验检测Ad/Bcl-2转染的ADSCs与单纯Ad转染的ADSCs在不同时间点表达Bcl-2蛋白的水平,取转染24h、72h和7d的Bcl-2-ADSCs及vector-ADSCs、 ADSCs进行实验。体内试验1.48只10周龄雌性实验用裸鼠,体重在25-30g之间,适应性饲养1周后制备糖尿病模型。每只裸鼠背部设计一个直径0.7cm的圆形皮肤缺损创面。根据治疗方式将48只裸鼠随机分为4组：A组(PBS组,n=12)：创面局部喷洒PBS溶液；B组(scaffold组,n=12)：创面局部应用空白胶原膜片；C组(ADSCs/scaffold组,n=12)：创面局部应用结合ADSCs的胶原膜片；D组(BCL-2/ADSCs/scaffold组.,n=12)：创而局部应用结合BCL-2转染ADSCs的胶原膜片；2.在手术当中以及术后3天、7天、10天和14天拍摄创面照片,计算各组创面愈合率；3.Dil标记ADSCs及BCL-2转染的ADSCs,术后第7d取C组及D组创面肉芽组织制成冰冻切片,荧光显微镜下观察ADSCs细胞存活情况；4.各组于术后第7d取创面肉芽组织行组织学观察,包括HE染色,免疫组化染色,比较各组创而肉芽组织的血管化程度。结果体外实验1.扫描电镜显示：该胶原膜片具有疏松的三维空间立体结构,孔隙范围在150μm-200μm之间；2.流式细胞仪分析结果显示,ADSCs表达干细胞相关标记CD34、CD29、CD44和CD90,不表达HLA-DR,它是成纤维细胞的表型,也不表达血液来源的干细胞表型CD133。3. AD/EGFP转染ADSCs后在荧光显微镜下显示绿色荧光(图3A),MOI值分别为0、50、100、200时,经流式细胞仪检测,AD/EGFP的转染率分别为0、54%、79%、81.5%。4. Western blot检测显示Bcl-2转染24h后蛋白可以表达,随后表达逐渐增强,3天能够高表达,可持续到7天,vector-ADSCs和ADSCs仅能检测到微弱的内源性表达。体内实验1.与A组、B组及C组相比,D组创而愈合率在第7d为81.21±3.7%,显示出更高的创面愈合率(P0.05或P0.01)；2.C组与D组均可见被DiI标记的ADSCs在创而肉芽组织中存活,并在荧光显微镜下发出特殊的红色荧光；3.HE染色观察结果,与A组、B组及C组相比,D组创面肉芽组织切片表现出更显著的血管化程度；4.免疫组化染色结果,与A组、B组及C组相比,D组切片表现出更多的血管数目(A：6.11±2.78个,B：8.9±3.36个,C：15.21±3.87个,D：21.54±4.75个,P0.01)。结论1.外源性BCL-2基因能够上调ADSCs的BCL-2蛋白表达,转染BCL-2的ADSCs能够显著降低移植后ADSCs的凋亡；2.结合BCL-2转染ADSCs的胶原膜片能够显著的提高糖尿病裸鼠创面的愈合率,促进创面的愈合；3.结合BCL-2转染ADSCs的胶原膜片能够有效的增加血管的生成,从而促进糖尿病裸鼠创面的愈合。
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【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2

【参考文献】