胰腺星状细胞促进高糖诱导的胰岛β细胞损伤

发布时间：2019-05-10 14:18

【摘要】：第一部分：胰腺星状细胞促进高糖诱导的胰岛p细胞损伤目的近期研究发现2型糖尿病(T2DM)患者和动物模型的胰岛中存在活化的胰腺星状细胞(PSC)。PSC在一些胰腺疾病如慢性胰腺炎和胰腺癌中的致胰腺纤维化作用已被大量研究证实,但其在胰腺内分泌所起作用尚未明确。本研究拟通过体内、外实验来观察PSC对胰岛β细胞功能及活力的影响。方法常规胰腺组织块培养法分离wistar大鼠PSC,体外培养纯化至4-5代后,通过胰腺多点移植的方式植入正常血糖的wistar和自发性T2DM Goto-Kakizaki (GK)大鼠体内。未干预组和假手术组作为本实验的对照组(wistar大鼠未干预组、假手术组及移植组分别记为WU、WS、WT; GK大鼠未干预组、假手术组及移植组记为GU, GS、GT)。移植后密切监测血糖,移植16周后口服糖耐量试验(OGTT)检测各组大鼠血糖和葡萄糖刺激的胰岛素释放水平,并计算血糖和胰岛素曲线下面积。糖化血红蛋白(HbA1c)试纸检测HbAlc水平：胰腺组织切片行胰岛素免疫荧光染色观察胰岛形态并比较胰岛β细胞量：TUNEL和胰岛素免疫荧光共染观察胰岛p细胞凋亡；马松染色评估胰岛纤维化。体外研究采用PSC培养上清(PSC-CM)及高糖(HG组,葡萄糖浓度：25mmol/l)干预INS-1大鼠胰岛p细胞系,CCK-8试剂盒检测INS-1细胞活力；Annexin V/PI流式细胞分析检测INS-1细胞凋亡; western blot和real-time PCR检测INS-1细胞内质网应激(ER-stress)相关蛋白CHOP mRNA和蛋白表达水平。结果1.大鼠随机分组后监测基线水平胰岛功能,wistar大鼠三组间和GK大鼠三组间OGTT各点血糖值无统计学差异。移植16周后OGTT示GK大鼠糖负荷后30mmin血糖明显升高(GT:30.1±4.5 mmol/1 vs. GU:22.4±4.1 mmol/l 和 GS:23.2±1.9 mmol/1, P0.05),血糖曲线下面积增多(GT:2953.2±296.1 mmol/l·min vs. GU:2474.4±374.1 mmol/1·min 和 GS:2525.4±273.3 mmol/l·min, P0.05);空腹及糖负荷30 min血浆胰岛素水平下降(0min：GT:54.0±21.1 pg/ml vs.GU:94.8±73.8 pg/ml和GS:126.5±37.1 pg/ml,P0.05; 30min:GT:85.7±49.5 pg/ml vs. GU:128.7±74.3 pg/ml和GS:91.6±30.5 pg/ml, P0.01),相应的胰岛素曲线下面积下降(GT:8259.2±2345.8 pg/ml-min vs. GU:21364.9± 8173.4pg/ml-min和GS:19245.7±4191.9pg/ml·min, P0.05), GK大鼠移植组HbA1c升高(GT：9.8±1.4%vs.GU：8.8±1.0%和GS：8.5±1.0%,P0.05)。2.免疫组化染色结果发现PSC移植后GK大鼠胰岛形态受损更为严重,β细胞量减少(GT：0.09±0.03vs.GU：0.13±0.05和GS：0.12±0.06,P0.05),胰岛纤维化增加(GT：0.30±0.07vs.GU：0.22±0.08和GS：0.23±0.04,P0.05)。3.PSC移植后wistar大鼠WT、WU及WS三组间血糖、胰岛素及相应的曲线下面积、HbA1c、胰岛β细胞量及胰岛纤维化程度没有统计学差异。4.体外研究结果示和对照组相比,PSC-CM和HG单独干预都显著降低INS-1细胞活力,而在HG基础上添加PSC-CM干预损伤效应最明显(CCK-8检测的各组吸光度值：Control:1.02±0.02 vs. PSC-CM:0.92±0.02、HG:0.91±0.03及PSC-CM+HG：0.88+0.05,p均0.01)5.Annexin V/PI流式结果示四组凋亡水平分别为Control:1.7±1.2%、PSC-CM:10.5±1.1%、HG:13.7±0.5%及PSC-CM+HG:28.0±0.8%, (p 0.01)。6. western blot和real-time PCR结果示PSC-CM和HG明显上调CHOP的表达,共同干预组上调最显著。结论PSC移植导致GK大鼠血糖及HbAlc水平升高,胰岛素释放降低,胰岛β细胞量减少,胰岛纤维化及p细胞凋亡增加,表明PSC移植进一步加重了GK大鼠胰岛p细胞功能损伤,而wistar大鼠移植后未产生显著影响。体外高糖和PSC上清降低INS-1细胞活力,增加凋亡,增加CHOP的表达,提示PSC可能通过内质网应激进一步加重高糖对p细胞损伤。第二部分：大鼠胰岛星状细胞对胰岛β细胞的影响目的大量研究已经证实慢性胰腺炎、胰腺癌等疾病中出现的胰腺纤维化是由胰腺星状细胞(PSC)引起,但是2型糖尿病病程晚期出现的胰岛纤维化细胞学机制尚未完全明确。本研究应用改良的PSC的分离技术,从正常大鼠胰岛内分离星状细胞(ISC),并对其生物学特性加以鉴定,检测其对胰岛β细胞功能的影响方法胰腺组织外生培养技术常规分离PSC作为对照,本研究尝试采用胰岛贴壁培养法分离ISC,油红O及免疫荧光染色分别观察脂滴和平滑肌肌动蛋白-α(α-SMA)的表达来评估细胞活化状态,α-SMA、波形蛋白(vimentin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)用来鉴定ISC,免疫荧光检测细胞外基质(ECM)成分Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维(col-Ⅰ、col-ⅢⅢ)和纤维连接蛋白(FN)表达。CCK-8、划痕试验和transwell小室试验分别用来比较PSC和ISC在增殖、迁移能力的差别。通过非接触式共培养及ISC-上清(ISC-CM)协同高糖(25mmol/l)干预INS-1细胞,CCK-8实验观察ISC及高糖对INS-1细胞活力的影响,并通过脱细胞技术进一步分离ISC来源ECM与胰岛共培养,caspase-3活性试剂盒及FDA/PI共染检测胰岛细胞凋亡,更深一步分析其对胰岛细胞活力的影响。结果在细胞培养皿经过培养24 h后,胰岛贴壁,48 h内可见外形呈现多角形如星状的细胞自胰岛边缘外生。和静息状态PSC同步比较,ISC脂滴含量明显量少,且快速消失,随之表达α-SMA。传代活化后的ISC表达PSC的鉴定指标α-SMA、vimentin和GFAP,并且表达col-Ⅰ、col-Ⅲ和FN,为了和PSC区别,暂时将此类细胞称为胰岛星状细胞。体外培养12h、36h及72h后CCK-8实验各组OD值示ISC增殖能力明显弱于PSC(0.15±0.01、0.30±0.01、0.44±0.01 vs.0.15±0.01、0.25±0.02、0.37±0.02；12h,p0.05,余p0.01),划痕实验示24h后]SC迁移入无细胞区域的细胞量明显少于PSC(33.8±7.9vs.129.2±8.8,p0.01),transwell小室迁移实验示24h后穿过小室膜的ISC少于PSC(21.2±5.1 VS 50.0+10.2,p0.01)。INS-1细胞经ISC非接触式共培养及ISC-CM干预后CCK-8检测OD值降低,提示细胞活力下降,而在高糖共同干预下,破坏效应最为明显。通过脱细胞技术分离大鼠ISC-ECM,干预INS-1细胞24h后caspase-3活性检测OD值增加(339074.6±49799.2 vs.104809.1±2837.6,p0.01),ECM与胰岛共培养后胰岛形态破坏,FDA/PI染色示几乎100%细胞呈现PI阳性细胞。结论本次实验成功从新鲜分离的大鼠胰岛提取出星状细胞,这类ISC具有静息和活化两种状态,活化状态ISC可表达α-SMA、vimentin及GFAP,合成细胞外基质,具有星状细胞基本特性。但是其增殖和迁移能力明显弱于PSC。ISC可诱导胰岛细胞功能及细胞活力下降,尤其在高糖参与下损伤效应更明显,进一步分离的ISC-ECM可显著导致胰岛细胞受损。第三部分：人胰岛星状细胞对胰岛功能的影响目的前期研究从新鲜分离的大鼠胰岛中成功分离了胰岛星状细胞(ISC),这些细胞与经典的胰腺星状细胞(PSC)表型类似,可能参与2型糖尿病(T2DM)胰岛纤维化的发生。由于人和大鼠间存在种属差异,本研究将进一步尝试从人胰岛中分离星状细胞,并观察人ISC对胰岛功能的影响。方法通过标准的组织块外生培养技术,我们从新鲜分离的人胰岛中成功分离出ISC,同时,从人胰腺组织块中分离了胰腺星状细胞(PSC)作为本实验的对照。平滑肌激动蛋白-α(α-SMA)、结蛋白(desmin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、波形蛋白(vimentin)免疫荧光染色鉴定人ISC, CCK-8试验用来比较人ISC和PSC增殖速度差异,划痕实验及transwell小室迁移试验用来比较ISC和PSC的迁移能力,Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及纤维连接蛋白(Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN)免疫荧光染色观察ISC分泌细胞外基质(ECM)的能力。为了观察人ISC对胰岛功能及细胞活力的影响,我们将新鲜分离的人胰岛与体外培养活化后的ISC接触式共培养,葡萄糖刺激胰岛素释放试验检测胰岛素释放功能,caspase-3活性试剂盒检测胰岛细胞凋亡。进一步脱细胞技术分离人ISC-ECM干预人胰岛,FDA/PI双染观察胰岛细胞活力。结果贴壁培养的人胰岛外生细胞众多星状细胞,传代活化人ISC免疫荧光可见α-SMA、 desmin、vimentin、GFAP染色,表达col-Ⅰ、col-Ⅲ和FN。与PSC相比,人ISC增殖显著降低(24h、48h及72h三点CCK-8实验所测OD值：ISC 0.63±0.01、0.80±0.01及0.99±0.02 vs.0.65±0.05、1.03±0.02及1.40±0.01,24h点两组p0.05,余对比p0.01)。划痕实验示ISC 24h后迁移入无细胞区的细胞量较PSC明显减少(19.0±5.5 vs.51.8±10.2,p0.01), Transwell小室迁移实验示24h后ISC穿膜的细胞数较PSC明显减少(25.0±5.6vs.208.7±28.0,p0.01)。人ISC与胰岛接触式共培养后,葡萄糖刺激实验检测胰岛功能,2mmol/l及20mmol/l葡萄糖刺激下人胰岛的胰岛素释放水平均增强(0.8±0.2ng/islet/h vs. 4.111.5 ng/islet/h; 1.3±0.3 ng/islet/h vs.9.8±3.3 ng/islet/h, p0.05),而各组胞内胰岛素含量无统计学差异。Caspase-3活性试剂盒检测OD值示两组无统计学差异。进一步分离的人ISC-ECM免疫荧光染色观察到Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN的表达,ISC-ECM与胰岛共培养后,明显引起胰岛形态破坏,FDA染色可见少量细胞阳性,几乎100%细胞呈现PI阳性细胞。结论本次实验成功从新鲜分离的人胰岛提取出星状细胞,活化状态ISC可表达a-SMA. desmin、vimentin及GFAP,合成细胞外基质,具有星状细胞基本特性。但是其增殖和迁移能力明显弱于PSC。人ISC与胰岛接触式共培养后胰岛功能得到部分改善,但进一步分离的ISC-ECM可显著导致胰岛细胞死亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1
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本文编号：2473711