miR-144调节FLSs钙粘附蛋白-11表达及在RA病理进程中的作用

发布时间：2019-07-25 16:57

【摘要】：目的:类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种主要以关节滑膜组织炎症为特点的全身性自身免疫反应。该病可导致骨和软骨的破坏和变性,关节发生畸形和强直。RA发病机制复杂,目前仍未完全阐明,且病情常常迁延难愈,严重损害患者的生命健康。因此探讨RA的发病因素及致病机制对于RA疾病的治疗有重要的研究价值。本研究通过对关节滑膜成纤维细胞样滑膜细胞中钙粘附蛋白-11(Cadherin-11,可缩写为Cad-11)的表达与miR-144、RA的相关性进行研究,以探讨mi R-144过表达慢病毒在RA小鼠滑膜组织病理进程的作用及其病理机制。方法选择BALB/c 6-8周小鼠12只,雌雄各半,体质量为(20±2)g,随机选取将其随机分为3组,即正常组、佐剂组和模型组,其中模型组为将Ⅱ型胶原乳剂注射至BALB/c小鼠尾根部皮下构建由Ⅱ型胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠模型。进行各组膝关节滑膜组织的病理学比较。在细胞学层面上,进行成纤维细胞样滑膜细胞(FLSs)原代培养,并分组干预。分为空白对照小鼠(CT)FLSs组、类风湿关节炎模型(RA)FLSs组,RA+miR-144组及RA+Anti-mi R-144组,q PCR技术进行检测各组miR-144、Cadherin-11、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6水平,Western实验检测各组细胞中Cadherin-11的表达。进而利用ELISA测量培养细胞上清中炎性因子的含量,包括TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6等。在体内干预实验部分,利用12只CIA模型小鼠,随机分为3组,即盐水组,空载组和mi R-144组,其中mi R-144组是以miR-144过表达慢病毒进行尾静脉注射处理。对模型小鼠滑膜组织进行HRP标记抗体法及免疫组化检测Cadherin-11和TNF-α的表达和分布,并用HE染色检测滑膜组织的病理变化特点。结果(1)用于检测建模情况的3组小鼠分别经未做特殊处理、佐剂乳剂处理和Ⅱ型胶原处理处理后,其膝关节滑膜组织的病理切片在光镜下观察提示:正常组和佐剂组小鼠经不同处理后,其膝关节的滑膜组织中细胞分布均匀且排列规则,局部无炎性细胞浸润和血管翳形成,膝关节的软骨细胞排列规则、软骨组织表面光滑。模型组小鼠膝关节局部炎症反应明显,单核细胞大量增生,并有中性粒细胞和淋巴细胞的浸润,有部分组织的水肿和滑膜层细胞增生和血管翳的形成,滑膜组织中出现细胞纤维化和纤维性渗出,并有胶原纤维的沉积,关节软骨组织破坏严重。运用实时定量基因扩增荧光检测系统测定ct组和ra组mir-144、cadherin-11及炎性因子水平,结果显示,ra组mir-144明显低于ct组,cad-11、tnf-α、il-1、il-6水平明显高于ct组(p0.05),il-2两组未见统计学差异(p0.05)。(2)细胞学体外检测,在ra组及ra+mir-144组,其cad-11水平无统计学差异(p0.05),但均明显高于ct组和ra+anti-mir-144组(p0.05)。ra+mir-144组其tnf-α、il-1、il-6水平明显低于ra组(p0.05)。四组il-2水平无明显统计学差异(p0.05)。运用western-blot实验检测结果提示ct组和ra未转染mir-144组可观察到明显的蛋白印迹,经转染mir-144的ra小鼠成纤维细胞样滑膜细胞中未看到明显的蛋白印迹,而ra+anti-mir-144组同样可以看到明显的蛋白印迹。定量提示ra组cadherin-11水平明显高于ct组(p0.05),而经转染mir-144的ra小鼠flss中cadherin-11水平明显低于ra组与ra+anti-mir-144组(p0.05)。elisa结果提示ra+mir-144组其tnf-α、il-1、il-6水平明显低于ra组和ra+anti-mir-144组(p0.05),而ra组和ra+anti-mir-144组其tnf-α、il-1、il-6无明显统计学差异(p0.05)。四组中的il-2均无明显统计学差异(p0.05)。(3)在体实验部分,各组膝关节滑膜组织的病理切片在光镜下观察提示:盐水组和空载组小鼠经处理后,膝关节的炎症反应明显,炎性浸润并有滑膜细胞增生和血管翳生成,软骨组织受损。mir-144组小鼠膝关节的滑膜细胞均匀排列规则,局部无典型的炎症反应,软骨组织未受破坏。免疫组化染色显示:tnf-α散在分布于膝关节的滑膜层中。经image-proplus6.0软件分析,提示盐水组、空载组、mirna组tnf-α表达百分数分别为0.79±0.05、0.73±0.07、0.28±0.04;盐水组与空载组的ra模型小鼠滑膜层中tnf-α的表达水平相接近,两组间滑膜层tnf-α的表达水平无显著差异(p0.05);ra模型小鼠经mir-144高表达慢病毒处理后,滑膜组织tnf-α表达水平明显下降,其差异具有统计学意义(p0.05)。mirna高表达慢病毒处理后ra模型小鼠膝关节滑膜组织在荧光显微镜下观察提示:cadherin-11蛋白均匀地分布于膝关节的滑膜层细胞,细胞形态与既往报道的flss的形态一致。结果经image-proplus6.0软件分析,提示盐水组、空载组、mirna组cadherin-11表达百分数分别为0.45±0.07、0.36±0.06、0.12±0.03,盐水组和空载组经生理盐水与经空载慢病毒液处理的ra模型小鼠滑膜层细胞中cadherin-11蛋白表达水平相近,经检验,这两组之间滑膜层细胞的cadherin-11蛋白的表达水平无显著差异(p0.05);但实验组小鼠注射mi-RNA高表达慢病毒后,滑膜层细胞的Cadherin-11蛋白表达水平较其他组明显下降,经检验,注射mi RNA高表达慢病毒小鼠与其他两组小鼠之间滑膜层细胞Cadherin-11蛋白的表达差异具有统计学意义(P0.05)。结论机体中mi RNA-144增加可减弱或抑制关节炎模型小鼠中滑膜组织的炎症反应,并下调其TNF-α的表达,且这一作用是miRNA-144抑制滑膜细胞中Cadherin-11的效应。机体mi RNA-144的增加可以使RA模型小鼠滑膜炎症反应的病理进程趋于缓解和好转,并降低滑膜组织局部TNF-α、IL-1、IL-6水平的表达,因此,基于“miRNA-144高表达慢病毒”策略可望会成为治疗RA的重要手段之一,但其临床应用的可能尚需要更加深入的机制研究和大量的动物实验观察。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.22

【参考文献】