装载Klotho蛋白的多层复合纳米材料对于糖尿病溃疡的修复作用

发布时间：2019-09-04 16:52

【摘要】：糖尿病是一种全世界的多发疾病,据估计到2035年全世界会有3.8亿人患上糖尿病。糖尿病又是一种全身性疾病,由于人体自身的调节血糖水平的下降,导致全身处于相对高糖的状态。在高糖条件下,细胞会受到不同程度的损伤。细胞损伤导致的后果通常会出现在患者的神经系统、免疫系统以及循环系统等,这些系统的损伤会导致各种各样的并发症。循环系统的损伤会导致受影响的部位产生缺血缺氧等症状。在糖尿病患者当中,大约有20%的病人会患上糖尿病足溃疡。具体而言,糖尿病患者的皮肤,尤其是下肢皮肤供血不足,从而使皮肤处于缺血缺氧的状态,虽然皮肤本身有一定的侧枝循环或交通支能够缓解这种情况,但是糖尿病作为一种全身性疾病影响的并不是单一的血管或某一区域。一般来说,治疗的目的在于改善受损部位的循环状态,尽量凭借人体的自愈功能来达到康复。传统的针对糖尿病足的治疗方法主要包括止痛、高压氧、抗感染、降血糖和改善微循环,但治疗效果难以令人满意。干细胞治疗作为一种新兴的治疗方式,也越来越被研究人员所重视。骨髓间充质干细胞(BMSCs)凭借其强大的帮助组织再生以及无免疫原性的特点被广泛的应用于组织工程。已经有文献证明,BMSCs可以修复烧伤后以及缺血的皮肤,这提示我们BMSCs有可能对皮肤的损伤,比如糖尿病溃疡,有修复作用。但是BMSCs自身太过于脆弱,在由于高糖导致的缺血缺氧的糖尿病溃疡区域,BMSCs的存活、旁分泌以及抗凋亡作用都会被抑制。因此,如何提高BMSCs在恶劣条件下的生存率以及保证其功能成为我们的主要需要解决的问题。Klotho蛋白是由Kuro在1977年发现的一种与生命周期及代谢相关的蛋白。Klotho蛋白能够调节细胞内的钙磷代谢,并能够修复受损的肾小管上皮细胞。同时Klotho蛋白也能够在脂肪代谢、血管内皮修复、肿瘤的发生发展中起到重要的作用。以上研究提示我们,Klotho蛋白有可能对细胞有正面保护作用。我们通过细胞实验如MTT、EDU、transwell、划痕等一系列实验探究了Klotho蛋白对于BMSCs和ECs的作用,发现Klotho蛋白能够保护高糖条件下的BMSCS和ECs,促进BMSCs和ECs的增殖迁移,并能够通过对它们的保护作用来达到促进血管新生,从而达到治疗DFU的目的。为了使BMSCs能够在Klotho蛋白的刺激下直接在溃疡区域发挥其修复作用,我们选择了以PLGA、明胶和壳聚糖为主要原材料来制备一种固体载体。我们选择以电纺PLGA为主要技术手段,通过制备PLGA纳米纤维来为BMSCs提供合适的黏附生长环境。PLGA纳米纤维能够提供合适于细胞黏附的微环境,同时它本身也是一种控释材料。但是在传统的电纺过程当中,不可避免的会利用有毒溶剂和高电压,这些不利因素会影响需要控释的蛋白的活性。因此我们结合壳聚糖微球和明胶薄膜来控释Klotho蛋白,从而在制备复合材料的时候,能够避免这些不利因素对于蛋白质的影响,使Klotho蛋白能够保持活性,从而达到长时间刺激BMSCs的目的。该材料的结构类似于三明治,即是用两层PLGA薄膜包裹一层内含壳聚糖微球的明胶薄膜,最后在PLGA薄膜的表面移植上BMSCs。通过PLGA薄膜表面提供的纳米级多孔结构,BMSCs能够很好地粘附在材料表面,并不断的接受来自内层Klotho蛋白的刺激。相比于一过性的刺激,我们认为这种持续性的刺激能够使细胞更好的生存。我们通过电镜扫描观察了壳聚糖微球、PLGA薄膜表面、明胶薄膜表面的结构以及粘附PLGA薄膜表面的BMSCs的形态。证明了BMSCs能够在我们制作的材料上很好的黏附并显示出正常的形态。为了验证复合材料在修复DFU中的作用,我们将该复合材料应用于糖尿病溃疡的C57小鼠上,在五组小鼠身上验证了Klotho蛋白和BMSCs对于DFU愈合的效果,分别是对照组,Klotho+BMSCs组,单独BMSCs组,单独材料组和单独Klotho组。从结果看来,Klotho+BMSCs组取得了最好的愈合效果,其次是单独Klotho组,而其余三组愈合效果没有明显差异。证明了Klotho和BMSCs都能够帮助糖尿病溃疡愈合,但是单独的BMSCs在恶劣环境下无法生存,从而难以发挥正常的修复作用。本研究旨在探究Klotho蛋白在高糖条件下对于BMSCs及ECs的影响,并找到一种合适的载体能够将BMSCs种植在上面,同时该材料还具备一定的缓释功能。并找到一种合适的方式能够降低蛋白类药物在电纺的过程中的活性损伤的程度,从而能够让BMSCs能够在糖尿病溃疡的区域成功的生存并发挥对于创口的修复作用。主要的研究成果如下:1、证明了Klotho蛋白在高糖条件下能够促进BMSCs和ECS的增殖迁移。2、结合电纺丝技术制备了能够缓释Klotho蛋白同时能够提供合适于BMSCs黏附的微结构,从而保证BMSCs能够成功黏附生存的生物材料。3、证明了Klotho蛋白能够通过保护BMSCs和ECs来达到促进糖尿病溃疡区域的血管新生,从而促进溃疡区域的愈合。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2;TB383.1

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