高尿酸对TNF-α诱导的内皮细胞炎症反应的影响及机制研究

发布时间：2019-09-27 15:48

【摘要】：研究背景尿酸是鸟嘌呤和腺嘌呤代谢的主要代谢产物,具有抗氧化、调节内皮功能,当病理情况下,尿酸水平持续升高,诱发炎症反应、白细胞激活导致内皮功能受损。流行病学研究发现,尿酸不同程度的升高是糖尿病和冠心病的危险因素之一,但是尿酸能否作为独立的危险因素,参与疾病的发生发展以及预后仍有较大争议。近年来的国内外的研究提示,在稳定性心绞痛患者中,尿酸不同程度的升高与疾病的预后无明显相关,在急性冠脉综合征患者中,高尿酸血症与疾病的再发和死亡存在明显关系,但是与冠脉血管的严重程度没有关系。本课题前期临床研究也显示,急性冠脉综合征患者尿酸水平升高与其的预后相关,生存分析模型显示,尿酸水平在500-600μmmol/L时,冠心病患者的预后较差。尿酸与冠心病的关系与其它传统危险因素如高血压、糖尿病、高血脂、吸烟相比,其对心血管疾病的影响是单独起作用还是协同其他因素作用仍不清楚。目前国内外对于尿酸的研究多停留在临床分析和少量的体外细胞实验,对于高尿酸环境对内皮细胞发生炎症反应的影响及其相关的机制并不明了,有待进一步研究。研究目的研究不同浓度尿酸对TNF-α诱导的内皮细胞炎症反应的影响及其可能的相关机制。对象和方法1.研究对象人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)。2.研究方法2.1培养人脐静脉血管内皮细胞,用第4-6代的细胞用于实验。2.2用CCK-8试剂盒及MTT试剂盒测定不同浓度尿酸对于人脐静脉血管细胞的毒性和细胞增殖的影响。2.3不同浓度尿酸及TNF-α预处理处理人脐静脉内皮细胞:根据我们前期收集的冠心病人的临床资料,将高尿酸水平进行分层冠心病人群尿酸水平轻度升高平均值480μmmol/L,冠心病人群高尿酸水平的中度升高平均值590μmmol/L,冠心病人群高尿酸水平高度升高平均值700μmmol/L,确定用80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL的尿酸处理细胞,同时用10ng/mL的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的内皮细胞培养基处理。利用人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α,10ng/ml)做为阳性对照。H1:0ng/ml,对照组H2:hTNF-α:10ng/ml,阳性对照组H3:尿酸80μg/mL(冠心病人群高尿酸水平的轻度升高平均值)+hTNF-α(1 0ng/ml)组H4:尿酸10Oμg/mL(冠心病人群高尿酸水平的中度升高平均值)+hTNF-α(1 Ong/ml)H5:尿酸120μg/mL(冠心病人群高尿酸水平的高度升高平均值)+hTNF-α(10ng/ml)组2.4过氧化氢试剂盒测定细胞外过氧化氢(H202)和用荧光酶标仪测定细胞内活性氧。2.5 用 ELISA 测定 ET-1(endothelin-1)、TF(tissue factor)等因子蛋白水平的表达。2.6用q-PCR测定ET-1、TF等因子mRNA水平的表达。2.7用Western Blotting测定炎症因子ICAM-1、VCAM-1、IL-18的表达和信号通路蛋白t/p-IKKα,t/p-IκBα和内参蛋白β-actin的表达。3.统计方法使用版本为19.0的SPSS统计软件对实验结果进行数据分析。数据形式为均数±标准差。采用单因素方差分析的方法对各实验组和对照组进行比较。P0.05具有统计学意义,P0.01具有明显统计学意义。4.研究结果4.1当尿酸浓度在80μg/mL、10Oμg/mL、120μg/mL时HUVEC的细胞活力未出现明显下降(P0.05),表明这三个浓度对人脐静脉血管内皮细胞的活力基本无影响,当尿酸浓度在200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL时人脐静脉内皮细胞的活力则显著下降(P0.05)。4.2H202在H1、H2、H3、H4、H5这五个组的表达为2.46±0.25μmmol/L、3.700±0.07μmmol/L、4.75±0.02μmmol/L、5.20±0.23μmmol/L、3.722±0.26μmmol/L。与H2组相比,H3、H4组中H202的分泌明显高于H2组(P0.05);细胞内活性氧(ROS)的OD值在H1、H2、H3、H4、H5组分别为36.5±6.1、638.2±26.8、1196.5±74、1400.8±111、888.2±87.2。与 H2 组相比,H3、H4 组中ROS的分泌明显高于H2组(P0.01),表明尿酸能促进TNF-α诱导的细胞内活性氧和细胞外过氧化氢的产生。4.3 ET-1 在 H1、H2、H3、H4、H5 组表达分别为 199.2±13.0 pg/mL、802.6±72.7pg/mL、1134.4±135.0 pg/mL、1255.6±275.4 pg/mL、463.1±147.0 pg/mL。与H2组相比,H3、H4组中ET-1的分泌明显高于H2组(P0.05);TF在 H1、H2、H3、H4、H5 组表达分别为 74.5±7.6pg/mL、142.0± 15.0pg/mL、211±26.0 pg/mL、250±37.3 pg/mL、254.4±30.2 pg/mL 的水平升高。与 H2 组相比,H3、H4、H5组中TF的分泌明显高于H2组(P0.01);ET-1、TF在mRNA水平的变化与其蛋白水平变化基本相符合,表明尿酸能使TNF-α诱导的内皮细胞炎症反应水平升高。与H2组相比,H3、H4、H5组中VCAM-1的分泌明显高于H2组(P0.01)。与H2组相比,H4、H5组中ICAM-1的分泌明显高于H2组(P0.01)。与H2组相比,H3、H4组中IL-18的分泌明显高于H2组(P0.01)。4.4尿酸对TNF-α诱导的内皮细胞的NF-κB信号通路t/p-IKKα,t/p-IκBα蛋白表达无明显差异。5.研究结论5.1尿酸能增加TNF-α诱导的内皮细胞氧化应激及其产物和炎症因子的产生。5.2尿酸对TNF-α诱导的内皮细胞的IKKα-IκBα信号通路(NF-κB)未见明显影响。
【图文】：

脐静脉内皮细胞,尿酸,人脐静脉内皮细胞,细胞活力

图３－１不同尿酸浓度对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｕｒｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｏｎ邋ｈｕｍａｎ邋ｕｍｂｉｌｉｃａｌ邋ｖａｓｃｕｌａｒ邋ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．逡逑Ｈｕｍａｎ邋ｕｍｂｉｌｉｃａｌ邋ｖａｓｃｕｌａｒ邋ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｅｘｐｏｓｅｄ邋ｔｏ邋ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ逡逑ｕｒｉｃ邋ａｃｉｄ邋（５０－８００邋＾ｇ／ｍｌ），ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｅｘｔｅｎｔ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｗａｓ邋ｍｅａｓｕｒｅｄ邋ｂｙ逡逑ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ－８邋ｋｉｔ邋．Ｔｈｅ邋ｖａｌｕｅｓ邋ａｒｅ邋ｔｈｅ邋ｍｅａｎｓ邋ｏｆ邋ｔｈｒｅｅ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．逡逑见图邋３－１，用邋５０（ｉｇ／ｍｌ、１００｜ｉｇ／ｍｌ、２００＾ｉｇ／ｍｌ、４００｜ｉｇ／ｍｌ、８００｜ｉｇ／ｍｌ邋的尿酸逡逑干预人脐静脉内皮细胞１２小时后，，过高浓度的尿酸对细胞活力的抑制比较明显，逡逑其中在尿酸浓度超过２００ｐｇ／ｍｌ的时候细胞的活力下降明显（尸＜０．Ｗ）。逡逑

细胞活力,脐静脉内皮细胞,静脉内,实验组

ｗａｓ邋ｍｅａｓｕｒｅｄ邋ｂｙ邋ＭＴＴ邋ｋｉｔ邋．Ｔｈｅ邋ｖａｌｕｅｓ邋ａｒｅ邋ｔｈｅ邋ｍｅａｎｓ邋ｏｆ邋ｔｈｒｅｅ邋ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ逡逑ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．逡逑见图３－２，逦８０｜ｉｇ／ｍｌ、１００｜ｉｇ／ｍｌ、１２０（ｉｇ／ｍｌ这三个尿酸浓度对人挤静脉内逡逑皮细胞（ＨＵＶＥＣ）的增殖和细胞活力基本无影响，各实验组间ＨＵＶＥＣ的增殖逡逑和细胞活力差异无统计学意义（Ｐ＞ａ0５）。逡逑３７逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R589.7

【参考文献】