sFRP3抑制Wnt5a引发的非经典Wnt信号通路促进大鼠骨间充质干细胞成骨分化

发布时间：2019-10-12 01:21

【摘要】：研究目的本实验通过培养及鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,检测其在s FRP3及Wnt5a等因素干预下,碱性磷酸酶、胞膜上的卷曲蛋白(Frizzled)及胞内的β-catenin蛋白含量的变化,来探究s FRP3能否促进BMSCs成骨分化及是否通过Wnt信号通路影响间充质干细胞成骨分化,从而为治疗骨质疏松提供新的理论及方法。研究方法取4-6周龄大鼠股骨和胫骨骨髓腔内骨髓单个核细胞,并通过多次换液及BMSCs的细胞贴壁特性进行纯化。利用DMEM培养基对大鼠骨髓间充质干细胞进行原代及传代培养,并利用流式细胞仪对细胞表面标志物进行鉴定。将传代好的第三代细胞进行冻存。首先我们采用MTT法研究s FRP3及Wnt5a对鼠BMSCs增殖的影响。通过在酶标仪上测定各孔光吸收值,观察s FRP3及Wnt5a对细胞增殖的影响。接着我们研究不同浓度的s FRP3及Wnt5a对大鼠BMSCs成骨分化的影响。处理组细胞加入不同浓度的s FRP3及Wnt5a作为刺激因子,设立空白对照组,并进行成骨诱导,于第6天进行碱性磷酸酶染色,利用ELASA检测法,检测细胞胞浆中碱性磷酸酶的水平。随后我们研究s FRP3是否通过Wnt信号通路促进大鼠BMSCs成骨分化。将1n M s FRP3、1n MWnt5a及1n M s FRP3+1n MWnt5a分别加入细胞孔板中,并设立对照组,进行成骨诱导,同样利用ELASA检测法,检测细胞胞浆中碱性磷酸酶的水平。并提取各组的细胞的总蛋白,利用Western blot检测各组细胞特异性抗体卷曲蛋白(Frizzled)及β-catenin的含量。结果1.s FRP3及Wnt5a对大鼠BMSCs增殖有抑制作用,随浓度的增加,抑制作用增强,细胞数目减少。2.与对照组对比,随s FRP3浓度的增加,细胞胞浆中碱性磷酸酶水平逐渐增加,各组之间进行统计学分析,P0.05,差异具有统计学意义。3.与对照组对比,随Wnt5a浓度的增加,细胞胞浆中碱性磷酸酶水平逐渐降低,各组之间进行统计学分析,P0.05,差异具有统计学意义。4.对1n M s FRP3、1n MWnt5a、1n M s FRP3+1n MWnt5a及空白对照组中细胞胞浆中碱性磷酸酶水平进行检测,s FRP3组s FRP3+1n MWnt5a组空白对照组Wnt5a组,各组之间进行统计学分析,P0.05,差异具有统计学意义。5.对1n M s FRP3、1n MWnt5a、1n M s FRP3+1n MWnt5a及空白对照组中胞膜上的卷曲蛋白(Frizzled)及胞内的β-catenin蛋白进行Western blot检测并进行半定量分析,根据蛋白电泳条带从深到浅排列,其顺序为s FRP3组、空白对照组、s FRP3+1n MWnt5a组、Wnt5a组。结论1.s FRP3及Wnt5a抑制大鼠骨髓间充质细胞增殖。2.s FRP3能促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,并促进碱性磷酸酶的表达,相反Wnt5a抑制大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,并抑制碱性磷酸酶的表达。3.s FRP3抑制Wnt5a从而促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,并促进碱性磷酸酶的表达。4.s FRP3抑制Wnt5a引发的非经典的Wnt信号通路,从而促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。
【图文】：

示意图,相互影响,信号通路,与非

图 1 经典的与非经典的 Wnt 信号通路相互影响Yamada 等[24]研究发现，通过骨诱导，sFRP3 和 SFRP4 具有调节骨间充质干细胞向成骨分化的潜力，其中 SFRP4 主要参与经典 Wnt 信号传导通路调节成骨分化，而 sFRP3 则通过非经典 Wnt 信号通路调节成骨分化。在体外 pull-down实验显示 sFRP3 与 Wnt5a 相关联。基于以上研究，我们设想 sFRP3 通过与 Wnt5a蛋白结合，从而抑制非经典 Wnt/β-catenin 信号通路，经典的 Wnt/β-catenin 信号通路受到的抑制作用得到减轻，最终促进骨髓间充质干细胞成骨分化（图 2）。图 2 设想 sFRP3 作用于 Wnt 信号通路示意图研究目的、方法

曲线,实验流程,第三,间充质干细胞

BMSCs 成骨分化及是否通过 Wnt/β-catenin 信号通路影响间充质干细胞成骨分化，从而为治疗骨质疏松提供新的理论及方法。本实验设计主要由三部分组成，，第一部分主要验证检测其在不同浓度 sFRP3及 Wnt5a 对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响。将不同浓度 sFRP3 及 Wnt5a 分别干预鼠骨髓间充质干细胞，采用 MTT 法，通过在酶标仪测定各孔光吸收值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞增长曲线。第二部分主要验证 sFRP3 及 Wnt5a 能否促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。将不同浓度 sFRP3 及 Wnt5a 分别干预大鼠骨髓间充质干细胞，设立对照组，进行成骨诱导，利用 ELASA 检测法，检测细胞胞浆中碱性磷酸酶的水平，并进行统计学分析。第三部分主要验证 sFRP3 及 Wnt5a 的关系及 sFRP3 是否通过 Wnt/β-catenin信号通路影响大鼠间充质干细胞成骨分化。将 sFRP3、Wnt5a 及 sFRP3+Wnt5a分别干预细胞，设立对照组，利用 ELASA 检测法，检测细胞胞浆中碱性磷酸酶的水平，利用 Western blot 检测胞膜上的卷曲蛋白（Frizzled）及胞内的 β-catenin蛋白含量的变化，并进行统计学分析（图 3）。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R580

【参考文献】