间充质干细胞调控巨噬细胞在治疗系统性红斑狼疮中的作用研究

发布时间：2019-11-08 01:25

【摘要】：背景:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种多器官受累的系统性自身免疫病,主要表现为T、B细胞异常激活,自身抗体累积,炎性细胞因子增多等。近年来研究显示,巨噬细胞在SLE发病机制中扮演重要角色。而本课题组发现对于部分难治性SLE患者,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)移植治疗取得了较好的疗效,但MSC治疗SLE的机制及其对SLE巨噬细胞的调控尚不清楚。目的:本研究系统地分析了 SLE巨噬细胞的表型和功能;体外探讨UCMSC对SLE巨噬细胞表型和功能的影响;并通过狼疮鼠模型进一步探讨UCMSC移植治疗对狼疮鼠腹腔及肾脏巨噬细胞的影响。方法:密度梯度离心法(Ficoll法)分离SLE患者和健康对照(HC)外周单个核细胞(PBMC),磁珠分选CD14+单核细胞,应用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导7天,分化为成熟巨噬细胞,更换培养液,将此巨噬细胞以5:1比例在transwell培养体系下与或不与UCMSC共培养2天。流式细胞术(FACS)检测巨噬细胞表面CD206表达,Real-time PCR和ELISA法检测巨噬细胞相关细胞因子IL-10、TGFβ1、TNFα和iNOS表达。取健康人CD4+T细胞,以5:1比例分别与HC、SLE、UCMSC处理SLE巨噬细胞共培养,抗CD3/CD28刺激4天,CFSE标记检测CD4+T细胞增殖比例。应用2μm荧光微球(1:100稀释)与HC巨噬细胞、SLE巨噬细胞、UCMSC处理SLE巨噬细胞共培养2小时,FACS检测巨噬细胞吞噬活性。取健康人中性粒细胞,体外37℃培养24小时后,检测凋亡率后,作为凋亡细胞备用。应用CFSE标记凋亡细胞,以5:1比例分别与HC巨噬细胞、SLE巨噬细胞、UCMSC处理SLE巨噬细胞共培养2小时,FACS检测巨噬细胞吞噬凋亡细胞能力。同时检测UCMSC基础状态、与HC巨噬细胞以及与SLE巨噬细胞共培养条件下,UCMSC免疫调节因子的表达水平。动物体内实验中,我们将24周龄雌性B6.MRL-Faslpr狼疮鼠随机分为4组,分别为空白对照组、UCMSC移植治疗组、环磷酰胺(cyclophosphamid,CTX)治疗组和成纤维细胞(fibrolast-like synoviocytes,FLS)移植对照组,24 周龄雌性 C57BL/6 鼠作为正常对照。UCMSC和FLS均以1 × 106数量尾静脉输注相应治疗组狼疮鼠体内,CTX组狼疮鼠腹腔注射CTX 100mg/kg/day 2天,全部小鼠于28周龄处死。我们检测小鼠肾脏病理、脾脏指数和脾脏各淋巴细胞分群,评估疗效。同时将小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏巨噬细胞分离纯化,流式细胞术检测巨噬细胞表面CD206表达,在或不在LPS刺激下,ELISA法检测小鼠巨噬细胞IL-10、TGFβl和TNFα的水平。同时无菌取8周龄雌性C57BL/6小鼠脾脏,磁珠分选脾脏CD4+T细胞,将其以5:1比例与实验小鼠巨噬细胞共培养,抗CD3/CD28刺激4天,CFSE法检测CD4+T细胞增殖。应用2μm荧光微球(1:100稀释)与小鼠腹腔/肾脏巨噬细胞共培养2小时,FACS检测巨噬细胞吞噬活性。结果:SLE巨噬细胞表面CD206表达量显著下降,抗炎细胞因子IL-10和TGFβ1表达显著降低,而且SLE巨噬细胞不能有效抑制CD4+T细胞增殖,与此同时SLE巨噬细胞对荧光微球和凋亡细胞的吞噬率下降。UCMSC可显著提高SLE巨噬细胞表面CD206表达量,逆转其对CD4+T细胞增殖抑制能力缺陷,增强对荧光微球和凋亡细胞吞噬率,但UCMSC对SLE巨噬细胞细胞因子的作用甚微,仅能下调LPS刺激下TNFα的水平,而对IL-10、TGFβ1和iNOS无明显作用。与此同时我们发现,SLE巨噬细胞可显著上调UCMSC部分免疫调节分子(HGF、TGFβl和HO-1)。体内实验验证UCMSC移植治疗可显著上调狼疮鼠腹腔巨噬细胞和肾脏巨噬细胞CD206表达,显著提高狼疮鼠腹腔巨噬细胞和肾脏巨噬细胞对CD4+T细胞增殖的抑制能力,增强狼疮鼠腹腔和肾脏巨噬细胞对荧光微球的吞噬能力,而UCMSC移植治疗并不能显著影响狼疮鼠巨噬细胞相关细胞因子的表达,与体外结果一致。结论:SLE巨噬细胞表型、抗炎细胞因子表达、免疫调节能力和吞噬功能均异常。UCMSC可改善SLE巨噬细胞表型、免疫调节能力和吞噬功能,但对促炎-抗炎相关因子的产生影响甚微。UCMSC移植治疗狼疮鼠可显著改善狼疮鼠腹腔和肾脏巨噬细胞表型、免疫调节能力和吞噬功能,提示UCMSC对SLE巨噬细胞的调控有可能是UCMSC发挥治疗作用的一个重要机制。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.241

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本文编号：2557584