【摘要】：皮肤的难愈性溃疡是糖尿病患者常见的微血管并发症,是糖尿病患者致残、致死的重要因素,目前尚无有效的预防与治疗措施。创面炎症慢性迁延及血管再生障碍是其显著病理特征,也是具有前景的治疗靶点。环氧-二十碳三烯酸(EETs)是花生四烯酸细胞色素P450表氧化酶(CYP)的代谢产物,具有广泛生物效应,尤其对炎症、血管再生等病生理过程具有重要调控作用。有学者研究发现,糖尿病血管内皮的CYP的表达量低于正常水平。糖尿病难愈性溃疡的形成是否与CYP/EETs代谢通路异常有关?目前尚不清楚。研究目的：本课题利用小鼠皮肤创面模型,比较分析糖尿病及非糖尿病小鼠皮肤创面CYP代谢酶类的表达差异及其与创面愈合指标的相关性；观察外源性EETs、EET拮抗剂对创面愈合的影响,以及对炎症、血管再生相关指标的影响。进一步在糖尿病患者与非糖尿病患者的肉芽组织实验中验证CYP代谢酶类的表达差异与创面愈合的关系。研究内容：构建小鼠背部皮肤损伤模型后,ob/ob小鼠被随机地分为11,12-EET治疗组、EETS拮抗剂治疗组、胰岛素治疗组、生理盐水治疗组,C57BL/6小鼠被注射生理盐水作为对照组。利用Western Blot、real-time PCR、 ELISA、免疫组织化学染色、免疫荧光组织染色等方法,在不同观察时间点,检测小鼠皮肤创面组织P450表氧化酶(CYP2C65、 CYP2J6) mRNA及蛋白表达水平；中性粒细胞浸润数目、单核/巨噬细胞浸润数目、炎症性细胞因子水平,即tumor necrosis factor (TNF)-a, interleukin (IL)-6、IL-1p的水平、金属基质蛋白酶蛋白表达水平以及创面边缘皮肤组织及新生肉芽组织毛细血管密度。并观察外源性EET(11,12-EET)及EETs拮抗剂(14,15-EEZE)干预后上述各项指标的变化及其对创面愈合指标的影响。研究结果：1、与C57BL/6小鼠相比,ob/ob小鼠的CYP2C65和CYP2J6的mRNA表达水平显著降低(P0.05)；同样,ob/ob小鼠肉芽组织中CYP2C65和CYP2J6蛋白的表达水平与对照鼠相比显著降低(P0.05)。2、生理盐水干预后,ob/ob小鼠的创面愈合速率显著地慢于C57BL/6小鼠；与生理盐水治疗组的ob/ob小鼠相比,11,12-EET可明显加快ob/ob小鼠的创面愈合(P0.05)；相反地,EETs拮抗剂可以明显延缓ob/ob小鼠的创面愈合,而胰岛素治疗组与生理盐水治疗组的创面愈合速率无显著差别(P0.05)。3、ob/ob小鼠创面肉芽组织中中性粒细胞数目及单核/巨噬细胞的数目显著地多于C57BL/6小鼠。在ob/ob小鼠中,11,12-EET相较于生理盐水可显著抑制中性粒细胞及单核/巨噬细胞的浸润数量(P0.05)。4、ob/ob小鼠肉芽组织中IL-1p、IL-6及TNF-α的水平显著高于C57BL/6小鼠(P0.05),ob/ob小鼠经11,12-EET治疗后,IL-1β、IL-6及TNF-α水平明显下降(P0.05),而经胰岛素治疗后IL-1p、IL-6及TNF-α水平变化不大。5、ob/ob小鼠与C57BL/6小鼠相比,MMP-9的蛋白表达量明显升高(P0.05),经11,12-EET治疗后,MMP-9的蛋白量明显降低(P0.05),而EET拮抗剂治疗后,MMP-9表达量明显升高(P0.05)。6、ob/ob小鼠创面的胶原沉积明显少于C57BL/6(P0.05)。与生理盐水治疗的ob/ob小鼠相比,11,12-EET治疗后创面胶原沉积明显增加(P0.05)。同时,胰岛素治疗没有表现出明显差别,而EET拮抗剂明显地抑制胶原沉积(P0.05)。7、创面创立第6天,新鲜的肉芽组织的免疫荧光染色显示ob/ob小鼠的血管样组织明显少于C57BL/6小鼠(P0.05)。11,12-EET治疗后,ob/ob小鼠的血管样组织相比于生理盐水治疗明显增加(P0.05),经胰岛素治疗后,数量变化不大。8、将糖尿病与非糖尿病的患者相对比发现,创面肉芽组织中的CYP2C65及CYP2J6蛋白表达量显著地低于正常(P0.05),但是MMP-9的蛋白表达量显著地高于正常(P0.05)。研究结论：1、糖尿病小鼠的创面肉芽组织CYP表氧化酶的mRNA及蛋白的表达水平明显降低。2、经EET治疗后,ob/ob小鼠的愈合速率显著增加。3、EET可显著地减少ob/ob小鼠创面肉芽组织中中性粒细胞以及单核/巨噬细胞浸润数目。4、EET可显著地使ob/ob小鼠创面肉芽组织中炎症性细胞因子表达量降低。5、EET显著降地低ob/ob小鼠创面肉芽组织中MMP-9的蛋白表达。6、EET显著增加ob/ob小鼠创面肉芽组织的胶原沉积。7、EET显著可促进ob/ob小鼠创面血管生成。8、糖尿病患者的难愈性溃疡的肉芽组织中CYP2C11及CYP2J2的蛋白表达量显著降低,MMP-9的蛋白表达量显著升高。总之,本研究发现CYP表氧化酶表达水平降低可能是导致糖尿病难愈性溃疡形成的重要因素之一。外源性EET可能通过其抗炎及加速血管再生促进糖尿病皮肤损伤愈合。研究意义：明确EETs/CYP代谢通路是影响糖尿病皮肤损伤愈合的重要因素之一；进一步揭示糖尿病难愈性溃疡的病理生理机制,为临床糖尿病难愈性溃疡的防治提供了新思路及治疗靶点。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2
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2557473
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