Mfn2对高糖诱导血管平滑肌细胞A7r5增殖及糖代谢相关基因表达的影响

发布时间：2019-11-28 10:41

【摘要】：目的糖尿病并发大血管病变发病率逐年上升,患者渐趋向年轻化。大血管病变最主要的病理基础是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)异常增殖并迁移至血管内膜下是AS形成的重要环节。线粒体融合蛋白2(mitofusin2,Mfn2)基因是近年来最发现的一种细胞增殖抑制基因,它能抑制肿瘤细胞的增殖,也参与线粒体的融合,调节线粒体的新陈代谢,维持线粒体的网状结构。高血压大鼠主动脉VSMC中Mfn2的表达有所下降,因此Mfn2表达上调可能会抑制该病理过程。本研究的目的为观察外源性Mfn2基因对高血糖引起A7r5细胞增殖以及对葡萄糖代谢通路相关基因表达的影响,以期为Mfn2成为血管病变的治疗靶点提供实验依据。方法根据葡萄糖浓度将A7r5细胞分为两组:对照组(葡萄糖浓度5.5m M)和实验组(葡萄糖浓度15、25、35、45m M),将各组细胞培养72小时后与MTT孵育,用酶联免疫检测仪测定490nm波长处OD值以确定适宜葡萄糖浓度。再按照该浓度分别培养细胞24h、48h、72h后行MTT检测确定适宜培养时间。应用流式细胞术检测各组细胞周期分布。然后将细胞分成两组:正常糖对照组和高糖实验组。RT-q PCR检测高糖对GLUT4,PPARβ,PFK,HK m RNA表达影响。细胞分为空白对照组,p EGFP-N1组和p EGFP-mfn2组。分别于培养24小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)的表达,于转染48小时收获上述细胞,行MTT检测细胞增殖,经RT-q PCR检测Mfn2对GLUT4、PPARβ、PFK和HK m RNA表达情况影响。采用两样本t检验和方差分析对数据进行统计学分析。结果(1)MTT结果:对照组(糖浓度5.5m M)和实验组(糖浓度分别为15、25、35、45m M)OD值相比较,实验组(15 m M:0.525±0.042,25 m M:0.680±0.031,35m M:0.635±0.012,45 m M:0.579±0.015)较对照组(0.373±0.045)均有升高,且差异均有统计学意义(均P0.05),尤其以25 m M组升高明显。25 m M组细胞培养0h(0.385±0.055)相比较培养24h(0.679±0.033),48h(1.075±0.046),72h(1.113±0.013)OD值均升高,差异均有统计学意义(P0.05),48h和72h比较差异无统计学意义(P0.05)。(2)流式细胞术检测结果:实验组G1期细胞比例(36.7%)与对照组(62.8%)相比降低,其差异有显著性(F=109.8,P0.05);实验组S期细胞比例(44.2%)较对照组(23.1%)增加,两组差异有统计学意义(F=103.1,P0.05)(3)转染后MTT检测结果:重组质粒扩增后转染A7r5细胞,荧光显微镜下观察,转染成功后可有GFP表达,能发出特异性绿色荧光,计算转染效率为60%。MTT检测显示,与未转染组(1.105±0.011)相比较,转染p EGFP-mfn2组(0.852±0.089)OD值降低,差异有统计学意义(P0.01)。转染p EGFP-N1组(1.070±0.053)细胞无明显变化,差异无统计学意义(P0.05)。(4)q PCR检测显示:与正常糖组(1)相比较,高糖组GLUT4(0.491±0.027)和PPARβ(0.521±0.273)降低,而PFK(2.426±0.610)和HK(5.757±0.946)表达水平升高,差异有统计学意义(均P0.05)。转染48h后实验组和两对照组相比较,p EGFP-mfn2组的GLUT4(9.62±0.762)和PPARβ(9.06±0.663)升高,而PFK(12.72±0.272)和HK(15.75±0.551)表达水平降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论1.高糖能促进A7r5细胞增殖,并能使得m RNA水平GLUT4和PPARβ表达下调,PFK和HK表达上调。2.Mfn2抑制高糖诱导的A7r5细胞增殖,并使得m RNA水平GLUT4和PPARβ表达上调,PFK和HK表达下调。
【图文】：

细胞培养,糖浓度,浓度效应,对照组

图 1-1 A7r5 细胞培养 48 小时（×100）增殖影响的浓度效应显示：与对照组5.5 mM相比较，15、25、升高，，且以25mM组升高最显著，与对照在5.5-25 mM浓度之间，OD值随糖浓度增势。故此选择25mM为最佳糖浓度进行后

糖浓度,葡萄糖,时间效应,统计学意义

其OD值均明显升高，且以25mM组升高最显著，与对照组相比差异均有统计学意义（均P<0.01）。且在5.5-25 mM浓度之间，OD值随糖浓度增加而升高，当浓度在35mM及以上时呈下降趋势。故此选择25mM为最佳糖浓度进行后续实验。见图1-2。图1-2 不同葡萄糖浓度对A7r5增殖的影响（*P＜0.05）3. 葡萄糖对 A7r5 细胞增殖影响的时间效应以含葡萄糖25mM的10% DMEM分别培养A7r5 24、48和72h，MTT检测结果示： 24、48 和 72h OD 值分别为（ 0.679±0.033 ）， (1.075±0.046) 和（ 1.113±0.013 ），均较 0h
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2

【参考文献】