RA-FLS的迁移、侵袭及RA相关miRNAs表达水平的检测

发布时间：2019-11-29 04:19

【摘要】：目的：比较类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)与正常关节成纤维样滑膜细胞迁移、侵袭能力,并检测RA相关miRNAs在两种细胞中表达水平的改变,为进一步研究miRNAs在RA发病中的作用及寻找RA治疗新的靶点提供实验依据。研究对象：类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞和正常人关节成纤维样滑膜细胞方法：选择类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞的细胞MH7A和正常人关节成纤维样滑膜细胞HFLS用于实验研究。MH7A和HFLS细胞生长至汇合度80%左右时进行细胞传代,三代至六代细胞用于实验研究。台盼蓝染色实验鉴定细胞活性。利用Transwell细胞迁移实验和Transwell细胞侵袭实验检测并比较两种细胞的迁移、侵袭能力。Trizol法分别提取两组细胞的总RNA,并进行RNA定量分析。按照SYBR(?)PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit(Takara,RR716)说明书进行Poly(A)加尾反应和反转录成cDNA。选定用于实验的miRNAs和内参,查找miRNAs数据库(http://www.mirbase.org),分别找到选定miRNAs的原始序列,并按照引物设计原则进行引物设计,合成扩增miRNAs的引物。进行实时定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),并对实验数据进行统计学分析。结果：培养的HFLS呈长梭形、多角形,具有突起,细胞胞体较大,边界不清晰,大小不均匀,MH7A为长梭形,排列规则。台盼蓝染色实验显示两种细胞的活细胞率均大于90%,符合实验要求。Transwell细胞迁移、侵袭实验显示MH7A迁移、侵袭能力较HFLS明显增强。选定相关的11种miRNAs用于实验,分别为miR-132、-155、-203、-223、-124、-15a、-16、18a、-19a、-26a、-146a,RT-qPCR检测miRNAs在两种细胞中的表达,与HFLS相比,MH7A细胞中miR-132、-155、-203、-223、-124的表达上调,其相对表达量升高,分别为2.328倍、3.882倍、6.020倍、1.343倍和1.831倍,差异有统计学意义(P0.05),其中miR-203表达升高最为显著；而miR-15a、-16、18a、-19a、-26a、-146a的表达下调,其相对表达量降低,分别为0.625倍、0.367倍、0.742倍、0.602倍、0.533倍和0.424倍,差异有统计学意义(P0.05),其中miR-16表达降低最为显著。结论：1.类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞迁移、侵袭能力较正常关节成纤维样滑膜细胞明显增强。2.RA相关的11种miRNAs在MH7A和HFLS中表达不同。RA-FLS中miRNAs的表达差异,可能直接或间接地通过调控MMPs和炎性细胞因子的分泌,调节RA-FLS的迁移和侵袭,参与RA的发病机制,这可能成为RA的诊断、监测及治疗的新靶点。
【图文】：

成极向分布，可见细胞集落。两种细胞均具有成纤维样细胞的特性，细胞呈梭逡逑形，长满时呈旋祸状分布。与ＨＦＬＳ细胞相比，ＭＨ７Ａ细胞体积较小，树突较少，少量呈圆逡逑形生长，胞质突起较少或较长（图２）。逡逑图２．Ｈ化Ｓ和ＭＨ７Ａ细胞形态W．左圈为Ｈ化Ｓ细胞（Ｘ２００）．右图为ＭＨ７Ａ细胞（Ｘ２００）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＨＦＬＳ邋ａｎｄ邋ＭＨ７Ａ．邋Ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ，邋ＨＦＬＳ邋（Ｘ邋２００）．邋Ｔｈｅ邋ｒｉｇｈｔ，邋ＭＨ７Ａ邋（Ｘ邋２００）．逡逑４．２逦ＭＨ７Ａ和Ｈ化Ｓ细胞的活性鉴定逡逑将ＨＦＬＳ和ＭＨ７Ａ细胞分别经台盼蓝染色后，死细胞染成蓝色，活细胞呈拒染。细胞活逡逑力计算：活细胞率（％）＝活细胞的总数／（活细胞的总数＋死细胞的怠数）Ｘ邋１００。显微镜下进逡逑行细胞计数后，结果提示ＨＦＬＳ活细胞率为９２％，ＭＨ７Ａ活细胞率为９５％，均大于９０％，符逡逑合实验要求。逡逑４．３与ＨＦＬＳ细胞相比，ＭＨ７Ａ细胞迂移、侵袭能力显著提高逡逑为了比较ＭＨ７Ａ与册ＬＳ细胞迁移、侵袭能力，我们分别进行Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ细胞迁移实验逡逑和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ细胞侵袭实验，结果表明ＭＨ７Ａ细胞穿过微孔膜的迁移能力较册ＬＳ细胞明显增逡逑强（户＜０．０５）（图３Ａ、Ｃ和Ｅ），ＭＨ７Ａ细胞的穿过Ｍａｔｒｉｇｅｌ胶的侵袭能力也较册ＬＳ细胞明显逡逑增强（图３Ｂ、Ｄ和Ｅ）（b6＜０．０５）。逡

成极向分布，可见细胞集落。两种细胞均具有成纤维样细胞的特性，细胞呈梭逡逑形，长满时呈旋祸状分布。与ＨＦＬＳ细胞相比，ＭＨ７Ａ细胞体积较小，树突较少，少量呈圆逡逑形生长，胞质突起较少或较长（图２）。逡逑图２．Ｈ化Ｓ和ＭＨ７Ａ细胞形态W．左圈为Ｈ化Ｓ细胞（Ｘ２００）．右图为ＭＨ７Ａ细胞（Ｘ２００）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．邋Ｔｈｅ邋ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ邋ｏｆ邋ＨＦＬＳ邋ａｎｄ邋ＭＨ７Ａ．邋Ｔｈｅ邋ｌｅｆｔ，邋ＨＦＬＳ邋（Ｘ邋２００）．邋Ｔｈｅ邋ｒｉｇｈｔ，邋ＭＨ７Ａ邋（Ｘ邋２００）．逡逑４．２逦ＭＨ７Ａ和Ｈ化Ｓ细胞的活性鉴定逡逑将ＨＦＬＳ和ＭＨ７Ａ细胞分别经台盼蓝染色后，死细胞染成蓝色，活细胞呈拒染。细胞活逡逑力计算：活细胞率（％）＝活细胞的总数／（活细胞的总数＋死细胞的怠数）Ｘ邋１００。显微镜下进逡逑行细胞计数后，结果提示ＨＦＬＳ活细胞率为９２％，ＭＨ７Ａ活细胞率为９５％，均大于９０％，符逡逑合实验要求。逡逑４．３与ＨＦＬＳ细胞相比，ＭＨ７Ａ细胞迂移、侵袭能力显著提高逡逑为了比较ＭＨ７Ａ与册ＬＳ细胞迁移、侵袭能力，我们分别进行Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ细胞迁移实验逡逑和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ细胞侵袭实验，结果表明ＭＨ７Ａ细胞穿过微孔膜的迁移能力较册ＬＳ细胞明显增逡逑强（户＜０．０５）（图３Ａ、Ｃ和Ｅ），，ＭＨ７Ａ细胞的穿过Ｍａｔｒｉｇｅｌ胶的侵袭能力也较册ＬＳ细胞明显逡逑增强（图３Ｂ、Ｄ和Ｅ）（b6＜０．０５）。逡
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.22

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本文编号：2567324