CDC42对胰岛β细胞胰岛素分泌的调节作用及其机制

发布时间：2019-12-05 18:39

【摘要】：研究背景和目的:糖尿病是由于体内胰岛素分泌失衡或外周组织对胰岛素抵抗导致胰岛素绝对或相对不足,导致的机体血糖持续升高,进而继发多组织器官损伤。CDC42是一个Rho家族GTPases的成员,有研究表明其具有调控胰岛素分泌的作用。本课题旨在利用胰岛β细胞特异性敲除CDC42小鼠模型进一步确定CDC42在葡萄糖刺激诱导胰岛素分泌(GSIS)过程中的可能分子信号通路,从而为阐明CDC42在胰岛β细胞分泌胰岛素中的作用及其机制提供实验依据。方法:1.利用生物信息学数据库分析CDC42在小鼠主要器官和不同年龄时胰腺中的表达情况;2.制备胰岛β细胞特异性敲除CDC42小鼠,PCR鉴定小鼠基因型并分离胰岛细胞Western blot分析小鼠是否构建成功;3.分离小鼠的胰岛以及制备抑制CDC42活性的MIN6细胞模型,分别检测β细胞在低糖、高糖、KCl刺激后胰岛素的分泌量并检测胰岛素基因的表达情况;4.利用免疫荧光技术,在荧光显微镜观察CDC42和胰岛素在不同条件刺激后的亚细胞分布,探讨β细胞结构功能的变化情况;5.机制分析:β细胞负载钙离子探针(Fluo-3 AM),实时监测细胞在不同条件刺激下胞内钙的动态变化;Q-PCR分析钙调节相关蛋白(NCX,SERCA,IP3R等)mRNA水平上的表达情况;Western blot检测相关转录因子,进一步确定CDC42通过调控胞内钙参与GSIS的作用机制。结果:1.CDC42在小鼠内分泌系统和神经系统的组织中表达量较高,在胰腺中有一定的表达,且在胚胎14天左右,CDC42在胰腺组织表达明显增加,在出生前达表达高峰,从出生至成年CDC42表达量维持一定的丰度;2.基因型鉴定和Western blot确定小鼠基因型,结果显示胰岛β细胞特异性敲除CDC42小鼠,其胰岛中的CDC42表达量显著下调80%;3.胰岛β细胞特异性敲除CDC42的胰岛β细胞下调GSIS中胰岛素的分泌,抑制CDC42活性同样导致MIN6细胞胰岛素分泌量减少;4.在MIN6细胞系中抑制CDC42活性导致胰岛素颗粒在胞膜附近大量积聚,MIN6细胞出现分泌功能障碍的表型;5.在β细胞中敲除CDC42或在MIN6细胞中抑制CDC42活性都减弱GSIS中[Ca2+]c的上调,且Q-PCR结果显示Calmodulin、Calcineurin和IP3R基因等钙调相关基因表达改变;同时敲除CDC42小鼠胰岛组织中Foxa2表达明显下调。结论:敲除胰岛β细胞CDC42基因或者抑制MIN6细胞的CDC42活性,均可导致胰岛素颗粒胞吐受阻,胰岛素分泌减少,其机制可能与CDC42缺失所致细胞内钙离子稳态失衡密切相关。此外,敲除CDC42所致的Foxa2表达下调,也可能参与了β细胞胰岛素的分泌调节。综上所述,我们的研究在体内和体外证明CDC42是β细胞葡萄糖刺激诱导的胰岛素分泌机制中重要的调节因子。
【图文】：

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研究背景糖尿病是由于胰岛β 细胞胰岛素分泌不足或外周组织胰岛素抗性增加血糖升高，继而引起多器官功能障碍的多基因疾病。在过去十年中，随式的改变，全世界的糖尿病患者急剧增加，已经有超过 3.8 亿患者，世织估计，到 2030 年这一数量将增加一倍以上。中国是糖尿病患者极剧之一（图 1.1），患者约占我国人口的十分之一[1, 2]。胰岛素是机体内唯低血糖，同时促进细胞中糖原、脂肪、蛋白质合成的蛋白类激素；是调糖代谢，脂肪代谢和生长、发育和衰老的必需元素。机体内 99%的胰岛胰岛β 细胞。然而，，当胰岛素分泌减少甚至没有胰岛素，或者身体对胰抵抗时，就可能引发机体血糖升高，发生糖尿病。同时，糖尿病也是造肾衰竭、截肢、心力衰竭和中风的主要原因。糖尿病主要分为 I 型糖尿尿病，当然也有其他类型，比如说妊娠期发生的妊娠糖尿病等[2, 3]。

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大多数细胞中，胞内钙离子主要有两个离子交换系统：质膜上a+/Ca2+exchanger, NCX）和质膜钙 ATP 酶(plasma membrane A)（图 1.2）。这两个系统相互补充，其中 NCX 的泵出能力强但（它耦合 3 个 Na+交换 1 个 Ca2+），因而它是带电荷的并受膜看到 NCX1 失活反而是有利于胰岛素的分泌[22]。PMCA 则相 Ca2+便会耦合大于 1 个或 2 个 H+，使得离子泵呈中性，因此维持静息状态的钙平衡[23-25]。同时在细胞中，内质网具有强大力，作为细胞内主要的钙库，内质网能有效的缓冲细胞内的 ATP 酶（sarco endoplasmic reticulum Calcium adenosine，SE库的功能中发挥决定性作用，SERCA 主要帮助内质网摄取和子，当抑制 SERCA 后，钙离子迅速的泵出，这说明细胞消耗换 ER 释放的 Ca2+，不过其具体的交换机制仍不清楚。最近几类型提出了几种钙离子调节候选蛋白：1,4.5 三磷酸肌醇受体（osphate receptor,IP3R），丙氨醛受体（theryanodine receptor，R体家族（transient receptor potential，TRP）成员（比如 Bcl-2，B
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.1

【参考文献】