AMPK对高糖诱导的系膜细胞connexin43下调及早衰的调控机制

发布时间：2017-03-20 09:03

  本文关键词：AMPK对高糖诱导的系膜细胞connexin43下调及早衰的调控机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的:系膜细胞肥大及衰老标志物表达增高是糖尿病肾病早期病理特征。已有研究证实Cx43在高糖导致的系膜细胞衰老过程起着重要作用，，但其调控机制尚不明确。在细胞内的信号网络中，AMPK/mTOR信号通路参与系膜细胞肥大与衰老过程的调控。本实验观察了在糖尿病肾病肾脏组织与相对正常肾脏组织中p-AMPK、细胞间隙连接蛋白connexin43及衰老相关调节蛋白p21的表达区别，研究高糖培养条件下系膜细胞衰老相关表型、细胞间隙连接蛋白Cx43及AMPK/mTOR信号通路的变化,并探讨它们之间的相互关系。 方法:收集病理诊断为糖尿病肾病的肾组织标本及肾切除手术中相对正常的肾组织标本，组织免疫荧光技术检测Cx43,p-AMPK及p21在糖肾及正常肾组织中的表达及分布。分离培养3月龄SD大鼠肾小球系膜细胞并鉴定,分为以下几组:正常糖组(5.5mM葡萄糖)、高糖组(30mM葡萄糖)、渗透压对照组(5.5mM葡萄糖+24.5mM甘露醇)、正常糖+AMPK抑制剂组、高糖+AMPK激活剂组、高糖+mTOR抑制剂组、高糖+mTOR抑制剂+AMPK抑制剂组。Western Blot检测connexin43、细胞周期调节蛋白p21、p27的表达水平及各组AMPK/mTOR信号通路的改变，细胞免疫荧光观察Cx43及AMPK的表达变化。检测各组细胞SA-β-gal染色阳性率,应用MTT、流式细胞仪检测细胞的增值能力及细胞周期变化。应用siRNA转染技术从基因水平抑制AMPK的表达，研究抑制AMPK对系膜细胞Cx43表达的调控作用和衰老表型的影响。 结果:组织免疫荧光检测发现Cx43在糖肾冰冻切片中的表达明显少于正常肾组织，同时AMPK的活性受到抑制，而细胞衰老相关调节蛋白p21的表达明显增高。高糖刺激使系膜细胞AMPK的活性受到抑制而mTOR被激活（P＜0.05），同时connexin43表达下调，细胞出现增殖能力下降，G0/G1期延长，伴随着细胞周期调节蛋白p21、p27的表达水平升高，SA-β-gal阳性率较对照组显著升高（P＜0.05）。正常糖时，通过siRNA-AMPK抑制AMPK的活性，减轻AMPK对mTOR的抑制作用，可以模拟高糖诱导的系膜细胞Cx43表达的下调及衰老表型。高糖培养系膜细胞时通过二甲双胍激活AMPK或雷帕霉素抑制mTOR的活性，可以恢复Cx43的表达并改善高糖诱导的衰老表型。而在雷帕霉素干预高糖培养的系膜细胞同时，抑制AMPK的活性，会加重细胞的衰老表型及减少connexin43的表达，可见AMPK对衰老表型及Cx43的调控存在除mTOR外的其他调节机制。 结论:高糖通过对AMPK相关通路及细胞间隙连接蛋白Cx43的表达的调控诱导原代系膜细胞出现衰老相关表型，激活AMPK或抑制mTOR活性均可改善Cx43的表达及系膜细胞的衰老表型，而AMPK对Cx43的影响除了通过对mTOR抑制作用实现外还存在其他的调节作用。AMPK对系膜细胞Cx43的表达和衰老表型的调控发挥着重要的作用，为其成为糖尿病肾病治疗的新靶点提供理论依据。
【关键词】：connexin43 AMPK mTOR 系膜细胞衰老 糖尿病肾病
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 绪论12-15
• 第2章 文献综述15-22
• 2.1 AMPK 的结构与主要调节机制15-17
• 2.2 AMPK 在肾脏的分布17-18
• 2.3 AMPK 在肾脏中的生理作用18-19
• 2.4 AMPK 在肾脏病理过程中的作用19-21
• 2.5 小结与展望21-22
• 第3章 材料与方法22-31
• 3.1 实验材料22-24
• 3.1.1 组织标本的收集22
• 3.1.2 实验细胞及动物22
• 3.1.3 主要试剂22-23
• 3.1.4 主要仪器23-24
• 3.2 实验方法24-31
• 3.2.1 组织免疫荧光染色24-25
• 3.2.2 细胞分离25
• 3.2.3 MTT 法检测细胞的增殖能力25-26
• 3.2.4 流式细胞仪检测细胞周期26
• 3.2.5 细胞的 SA-β-gal 染色26-27
• 3.2.6 siRNA 转染27
• 3.2.7 Western Blot 检测 Cx43、AMPK 等蛋白质表达水平27-29
• 3.2.8 细胞免疫荧光29-30
• 3.2.9 统计学处理30-31
• 第4章 结果31-46
• 4.1 评估 P-AMPK、CX43 及 P21 在糖尿病肾病中的表达变化31-32
• 4.2 建立高糖诱导的系膜细胞衰老模型32-34
• 4.2.1 高糖培抑制系膜细胞 AMPK 的活性及 Cx43 的表达32
• 4.2.2 高糖诱导系膜细胞出现衰老表型32-34
• 4.3 抑制 AMPK 活性对 CX43 及系膜细胞衰老表型的影响34-38
• 4.3.1 下调 AMPK 抑制了系膜细胞的 Cx43 的表达34-36
• 4.3.2 下调 AMPK 诱导系膜细胞衰老表型的出现36-38
• 4.4 激活 AMPK 对 CX43 及系膜细胞衰老表型的影响38-40
• 4.4.1 二甲双胍通过激活 AMPK 改善高糖对 Cx43 的抑制38
• 4.4.2 激活 AMPK 可以延缓高糖诱导的系膜细胞的衰老38-40
• 4.5 AMPK 调控 CX43 的表达及系膜细胞的衰老40-46
• 4.5.1 AMPK 对 mTOR 的负性调控40-43
• 4.5.2 AMPK 直接调节 Cx43 的表达及系膜细胞的衰老43-46
• 第5章 讨论46-49
• 第6章 结论49-50
• 参考文献50-60
• 作者简介及在学期间所取得的研究成果60-61
• 致谢61

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