自噬在高糖诱导的人肾小管上皮细胞脂毒性中的作用

发布时间：2017-03-19 22:08

  本文关键词：自噬在高糖诱导的人肾小管上皮细胞脂毒性中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景和目的糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最严重的并发症之一,显著增加了糖尿病患者的死亡率,也是导致全球终末期肾脏病(end-stage renal disease, ESRD)最常见的原因。糖尿病肾病的特点是肾小球和小管间质细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的过度沉积导致肾脏的进行性纤维化,最终引起组织的不可逆损伤和肾功能的下降。肾间质纤维化是糖尿病肾病发展到终末期肾衰竭的共同途径,而小管上皮细胞间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)被认为是肾间质纤维化的关键环节。前期研究指出高糖引起的脂毒性参与小管上皮细胞间充质转化,提示糖脂代谢紊乱与细胞功能的维护有着一定的联系。自噬是一种高度保守的“自我吞噬(self-eating)"机制,通过对胞内有毒物质及受损细胞器的降解及循环再利用维持细胞的稳态。有研究表明,调控自噬的相关营养信号通路也参与了许多代谢性疾病的发生发展。近年来自噬在糖尿病及其并发症的发病机制研究领域已引起广泛关注,被认为是预防或减缓糖尿病肾病发生发展的一个潜在靶点。基于自噬与糖脂代谢之间的紧密关系,本实验旨在探究高糖环境下肾小管上皮细胞(HK-2)自噬活性水平的改变及其与肾脏脂毒性和EMT之间的可能关联,为防治糖尿病肾病寻找可能的新靶点。方法1、人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)的培养及分组：细胞在5%CO2,37℃培养箱中,以含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,细胞隔天换液,2-3天传代一次,实验细胞分组：低糖组(LG,5.5 mmol/L葡萄糖),高糖组(HG,30 mmol/L葡萄糖),高糖+氯喹(CQ)组,高糖+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组,高糖+Atg5小RNA干扰组(Atg5 siRNA),高糖+Atg5干扰对照组.(Atg5NC),高糖+雷帕霉素(Rapamycin,Rap)组,高糖-DMSO对照组,高糖-Atg5 siRNA组+雷帕霉素组,高糖-Atg5 NC组+雷帕霉素组。2、应用western blot检测不同时间点高糖刺激下人肾小管上皮细胞自噬相关标志物Beclin1、LC3、p62的变化。3、高糖下应用自噬抑制剂CQ、3-MA和Atg5 siRNA干扰及激活剂雷帕霉素刺激细胞,光镜下观察不同刺激下HK-2细胞形态的变化。4、油红O染色检测不同刺激下人肾小管上皮细胞内脂质沉积的情况。5、应用western blot检测不同刺激下高糖培养的人肾小管上皮细胞EMT相关指标E-cadherin和Vimentin的变化情况。结果1、Western blot检测人肾小管上皮细胞自噬的变化：高糖刺激HK-2细胞6 h、24 h、48 h、96 h后,自噬相关指标Beclin1、LC3表达增多(P0.05),p62表达减少(P0.05)。2、光镜和油红O染色观察HK-2细胞形态变化和脂质沉积：光镜下正常HK-2细胞呈卵圆形,融合后呈铺路石样,高糖刺激96h后细胞呈长梭形改变,细胞连接松散,胞内出现红色的脂质沉积；加入自噬抑制剂CQ、3-MA及Atg5 siRNA干扰,刺激细胞48 h即可出现长梭形改变,并出现脂质沉积。而高糖下加入自噬激活剂雷帕霉素刺激96h,细胞也未出现明显的形态学改变及脂质沉积。3、Western blot检测HK-2细胞EMT相关指标的变化：与单纯高糖组相比,合并加入CQ、3-MA及Atg5 siRNA干扰刺激48 h后,间质细胞标志物Vimentin表达增加,上皮细胞标志物E-cadherin表达减少(P0.05)；加入Rapamycin刺激96h后Vimentin表达减少,E-cadherin表达增多(P0.05)。结论1、体外研究发现高糖培养下人肾小管上皮细胞自噬表达增强。2、抑制自噬可加重高糖引起的肾脏脂质沉积和EMT改变,雷帕霉素通过增强自噬可部分改善脂质沉积和EMT,因此可进一步将自噬作为防治DN的新靶点。
【关键词】：糖尿病肾病 自噬 脂毒性 上皮细胞间充质转化
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2
【目录】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 符号说明11-12
• 前言12-15
• 材料与方法15-25
• 结果25-27
• 讨论27-31
• 结论31-32
• 附图表32-40
• 参考文献40-45
• 致谢45-46
• 攻读学位期间发表的学术论文46-47
• 附件47

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李霖;李红;;糖尿病肾病与自噬[J];现代实用医学;2012年08期

  本文关键词：自噬在高糖诱导的人肾小管上皮细胞脂毒性中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：256676