1型糖尿病小鼠小肠平滑肌钙库操纵钙内流和小肠推进功能增强机制研究

发布时间：2020-03-14 00:23

【摘要】：背景糖尿病肠道病变是1型糖尿病常见并发症之一,常伴随腹泻等症状的发生,可能与肠动力功能紊乱有关,小肠平滑肌组织在维持肠道生理功能的过程中起到非常重要的作用,而Ca2+是介导平滑肌细胞收缩的重要的“第二信使”。钙库操纵的钙内流(Store-operated Ca2+ entry,SOCE)是普遍存在的外钙内流机制,参与调节包括平滑肌细胞收缩在内的多种生理功能,Orai1蛋白和基质相互作用分子1(STIM1)是钙库操纵的钙内流的主要组成成分,其中Orai1是位于细胞膜上的通道组成蛋白,STIM1是位于细胞内质网上单次跨膜蛋白,其位于内质网腔内侧的EF手型结构域能够感受到钙库耗竭引起的Ca2+浓度降低,使其与膜上Orai1蛋白形成聚集斑,从而介导SOCE。机体内持续高血糖会导致许多组织生理功能发生改变,因此,本研究试图检测1型糖尿病小肠平滑肌组织运动功能的改变及其与SOCE的关系。目的(1)观察高糖培养对小鼠小肠平滑肌细胞株MUS-M1细胞SOCE的影响(2)研究Orai1和STIM1在1型糖尿病小鼠小肠平滑肌收缩和推进功能中的作用方法1.细胞内钙离子浓度测量用高糖培养基与正常糖培养基培养MUS-M1细胞,分别通过激动剂诱导引起内钙释放,激活SOCE,利用钙成像荧光显微镜系统检测细胞内钙离子浓度变化。2.蛋白免疫印迹用Western Blot分别检测STIM1与Orai1在正常糖与高糖培养的MUS-M1细胞中表达水平以及糖尿病小鼠小肠平滑肌组织STIM1、Orai1及BKca蛋白表达水平。3.瞬时转染siRNA将特异性STIM1 siRNA、Orai1 siRNA分别转染MUS-M1细胞,36 h后将细胞进行后续实验。4.糖尿病模型的制备雄性小鼠,昆明种,5周龄,随机分为注射STZ糖尿病组(DM)和对照组(Control), DM组按40 mg/kg剂量腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)连续注射5天,制备糖尿病模型。正常组腹腔注射等剂量柠檬酸缓冲液。14天后测空腹血糖≥11.1 mmol/L者为DM模型。5.离体肠管制备以及张力测定离体小肠迅速放进Krebs溶液中等距分为等长肠管(约1 cm),一端固定到浴槽底部,一端连接到张力换能器上,用BL-420数据采集和分析系统分析肠管收缩能力。6.小肠推进功能用炭末半固体糊灌胃,测量标记物距胃幽门的推进距离占幽门到回肠末端长度比值作为推进功能标准。7.免疫共沉淀使用Orai1和BKCa抗体分别相互共沉淀,检测糖尿病小鼠小肠平滑肌组织BKc。与Orai1蛋白相互作用强度的变化。结果(1)随着高糖培养天数的增加,MUS-M1细胞SOCE程度逐渐增强；(2)高糖培养3天和7天的MUS-M1细胞,STIM1和Orai1蛋白表达水平显著增高；(3)降低STIM1和Orai1蛋白的表达水平可降低正常糖以及高糖培养的MUS-M1细胞SOCE;(4)糖尿病小鼠较正常小鼠小肠平滑肌组织STIM1和Orai1蛋白表达水平显著增高；(5)糖尿病导致SOCE介导的小鼠小肠平滑肌收缩强度增大,推进速度加快；(6)特异性STIM1 siRNA以及Orai1 siRNA可降低由糖尿病引起的小鼠小肠平滑肌收缩强度及小肠推进速度幅度；(7)小鼠小肠平滑肌组织Orai1与BKCa存在相互关系,糖尿病导致相互关系减弱。结论1.高糖刺激导致MUS-M1细胞Orai1和STIM1蛋白的表达升高,从而导致钙库操纵的钙内流增强。2.糖尿病小鼠小肠平滑肌细胞Orai1和STIM1蛋白表达显著增强,从而使小肠收缩以及推进速度加快。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1

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