雷公藤多苷对糖尿病肾病大鼠肾脏TGF-β1及FN表达的影响

发布时间：2017-03-21 04:01

  本文关键词：雷公藤多苷对糖尿病肾病大鼠肾脏TGF-β1及FN表达的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 2010年糖尿病患者人数达到2.85亿,将近全世界成人数量的7%,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者常见的慢性微血管并发症,也是终末期肾衰竭的最主要原因。DN的发生是多种原因综合作用的结果,近年来研究揭示DN的发病除了与代谢紊乱和血流动力学改变的影响有关外,炎症机制是其持续发展的关键因素之一,其中炎性细胞因子转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β,TGF-β1)、纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)起重要作用。雷公藤多苷是我国传统中草药,具有免疫抑制作用,目前已经广泛应用于多种自身免疫性疾病的治疗。其是否可以减少尿蛋白,改善肾脏损害,需要进一步研究证实。此外,观察DN时肾脏组织TGF-β1和FN的表达情况,有助于我们对DN发病机制的理解,还有重要的治疗意义。 本研究主要通过建立2型DN模型大鼠,应用雷公藤多苷(Tripterygium wilfordii polyglucoside,TWP)对该模型进行干预性治疗,观察实验动物的24小时尿蛋白、血常规、肝功能、肾功能,光镜、电镜观察肾脏病理形态学以及RT-PCR、免疫组织化学法分析肾组织中TGF-β1及FN等的变化,探讨雷公藤多苷对DN大鼠肾脏预防治疗作用的可能机制。 方法： 清洁级雄性SD大鼠136只,随机选取16只分为预防正常对照组(PNC组)、治疗正常对照组(TNC组),每组8只,饲以常规饲料；其余120只大鼠以高糖高脂饲料喂养4周联合小剂量STZ(30mg/kg)尾静脉注射建立T2DM模型,将成模大鼠随机分为预防模型对照组(PDM组)、预防雷公藤多苷低剂量组(PTL组,6mg/kg)、预防雷公藤多苷中剂量组(PTM组,12mg/kg)、预防雷公藤多苷高剂量组(PTH组,24mg/kg)及治疗模型对照组(TDM组)、治疗雷公藤多苷低剂量组(TTL组,6mg/kg)、治疗雷公藤多苷中剂量组(TTM组,12mg/kg)、治疗雷公藤多苷高剂量组(TTH组,24mg/kg),每组15只。雷公藤多苷预防组于成模后即开始灌胃,灌胃4周后处死；雷公藤多苷治疗组于成模后第5周开始灌胃,第8周末处死；PNC、TNC组和PDM、TDM组以等量蒸馏水灌胃。实验过程中记录大鼠体重(BW)、血糖、24小时尿微量白蛋白(UMA)变化,STZ注射前内眦取血测血脂。实验结束时：①留取血标本用于血常规、肝肾功能、血脂测定；记录BW、肾脏重量(KW)；②留取肾组织标本,光镜、电镜观察肾脏病理及超微结构的变化；RT-PCR法检测TGF-β1和FN的表达；免疫组化法检测TGF-β1和FN的表达,明确TGF-β1和FN在DN中的作用以及雷公藤多苷治疗的影响和可能机制。 结果 (1)成功制备DN模型,24h尿蛋白特点及肾脏病理变化符合人类2型糖尿病肾病的特点及病理变化。 (2)预防及治疗组模型大鼠血糖均维持在16.7mmol/L以上；肾重／体重的比重均较正常对照组增加(P0.05)；雷公藤多苷给药后各组肾重／体重的比重较模型组均有所降低,其中雷公藤多苷给药中剂量组下降最明显。 (3)预防组成模第4周末时,各组的UMA水平均比正常对照明显升高,雷公藤多苷给药后各组UMA均有所下降,其中给药中剂量组UMA水平下降最明显(P0.05)；治疗组成模第4周末及第8周末时,各组的UMA水平均较成模时明显升高(P0.05),成模第8周末时,模型对照组及雷公藤多苷给药各组的UMA水平均比正常对照组明显升高(P0.05),雷公藤多苷给药后各组UMA均有所下降(P0.05),其中PTM组UMA水平下降最明显(P0.05)。 (4)肝肾功、血脂结果显示：预防PTH组AST水平较其余各组明显升高(P0.05)；预防组各组间ALT、SCr及BUN水平比较无统计学差异(P0.05)；治疗组各组间AST、ALT、SCr及BUN水平比较也无统计学差异(P0.05)。高脂饲料饲养4周后,模型组大鼠TG、TC水平与正常组大鼠比较明显升高(P0.05),预防组和治疗组大鼠分别与正常对照组比较,模型对照组、雷公藤多苷给药各组TG、TC均明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。 血常规结果显示：雷公藤多苷治疗给药组淋巴细胞较TNC组明显降低(P0.05),雷公藤多苷预防组中淋巴细胞无明显差异(P0.05),其余白细胞、红细胞、血小板、血红蛋白、单核细胞和中性粒细胞在各组间均无明显差异(P0.05)； (5)光镜、电镜结果显示：预防组和治疗组中正常对照组大鼠肾小球体积、肾小球系膜区、肾小囊,肾小管及肾间质均未见明显异常。预防组和治疗组的模型对照组均可肾小球和肾小管DN的肾脏病理改变。雷公藤多苷给药后各组上述病理性改变均有所改善,其中雷公藤多苷给药中剂量组均改善最明显。 (6)实时荧光定量PCR显示,与正常对照组相比较,所有DM组TGF-β1、FNmRNA表达水平均显著升高,具有统计学意义(P0.05)；雷公藤多苷干预和治疗组的TGF-β1、FN mRNA表达水平与模型对照组比较均显著下降,具有统计学意义(P0.05)；其中,中剂量组表达量下降最显著,与其余各组比较均具有统计学差异。 (7)免疫组化结果显示,TGF-β1、FN在DM各组的肾小球及肾小管中均有表达,且主要表达于肾小管区域。雷公藤多苷干预和治疗组的TGF-β1、FNmRNA表达水平与模型对照组比较均显著下降,具有统计学意义(P0.05)；其中,中剂量组表达量下降最显著。 结论 (1)成功制备DN模型,24h尿蛋白特点及肾脏病理变化符合人类2型糖尿病肾病的特点及病理变化。 (2)雷公藤多苷给药后,预防组和治疗组UMA均有所下降,尤其是雷公藤多苷中剂量给药组UMA水平下降最明显,雷公藤多苷具有降低尿蛋白的作用,可有效延缓DN的发生发展。 (3)糖尿病大鼠肾脏组织炎性相关因子TGF-β1、FN的表达水平明显上调,提示肾组织局部的炎症反应和纤维化作用,导致肾小管间质及肾小球损伤,参与了DN的发生与发展。 (4)雷公藤多苷给药后,预防组和治疗组TGF-β1、FN表达量均分别较模型对照组显著下降,尤其是中剂量组TGF-β1、FN表达量下降明显,推测雷公藤多苷可能具有抑制炎性细胞因子的表达,减少肾组织局部的炎症反应和纤维化作用,从而延缓DN的发生发展。
【关键词】：雷公藤多苷 糖尿病肾病 FN TGF-β1 大鼠
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R587.2;R692
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• ~.略语/符号说明13-15
• 前言15-17
• 研究现状、成果15-16
• 研究目的与方法16-17
• 一、材料与方法17-30
• 1. 动物饲养和模型的建立、分组及取材17-21
• 1.1. 动物饲养和主要试剂、仪器17-18
• 1.2 实验方法18-21
• 2. 主要试剂及仪器21-22
• 2.1 Real-time(PCR)主要试剂及仪器21
• 2.2 免疫组化实验所需主要试剂及仪器21-22
• 2.3 主要溶液配制22
• 3. 实验方法22-29
• 3.1 逆转录-聚合酶链反应检测(RT-PCR)23-28
• 3.2 免疫组化法28-29
• 4. 统计学分析方法29-30
• 二、结果30-61
• 1. 建立了2型糖尿病SD大鼠模型30-43
• 2. RT-PCR法43-49
• 2.1 RNA纯度及完整性鉴定结果43
• 2.2 甲醛变性琼脂糖凝胶电43
• 2.3 普通PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳43
• 2.4 Real-timePCR检测目的基因mRNA水平43-49
• 3. 免疫组化方法检测TGF-β1、FN的蛋白水平表达情况49-55
• 3.1 免疫组化方法检测实验大鼠TGF-β1蛋白水平表达49-53
• 3.2 免疫组化方法检测实验大鼠FN蛋白水平表达情况53-55
• 4. 病理学检查55-61
• 4.1 光镜检查55-59
• 4.2 电镜检查59-61
• 讨论61-67
• 结论67-68
• 参考文献68-72
• 发表论文和参加科研情况说明72-73
• 综述73-85
• 综述参考文献80-85
• 致谢85

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 王朝虹,张吉林,何毅,侯小平;高效液相色谱法测定血浆中雷公藤甲素和雷公藤酮[J];中国法医学杂志;2004年05期

2 宋述菊;雷公藤在肾脏病方面的临床应用及进展[J];黑龙江中医药;2005年04期

3 温滨红;转化生长因子β_1在糖尿病肾病患者血清中的含量及其意义[J];辽宁实用糖尿病杂志;2004年04期

4 苏维广,孟江;雷公藤的临床应用[J];辽宁中医杂志;2003年10期

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本文编号：258957