中国绝经后女性血浆中骨质疏松症相关的炎症因子筛选

发布时间：2020-03-22 01:02

【摘要】：骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种以骨密度降低、骨的微结构被破坏和骨的脆性增加为主要特征的全身性慢性代谢性疾病,多发生在老年人和绝经后女性中。随着人口老龄化进程逐渐加快,骨质疏松症及其引起的骨质疏松性骨折已经成为了一个严重的公共卫生问题,造成了巨大的社会和经济负担。OP是多种因素联合作用形成的复杂疾病,目前关于OP的致病机理并未完全确定。本研究通过高通量蛋白芯片技术和细胞功能实验来筛选和验证OP相关炎症因子,以寻找OP潜在的生物标志物,同时为揭示OP的细胞分子机制及进行OP的早期预防提供科学依据。国内外大量研究表明,炎症因子在OP的发生发展过程中起着重要的作用。鉴于此,本研究从以下两个章节筛选和验证OP相关炎症因子,并对炎症因子与OP相关的细胞分子功能机制进行研究。第一章:运用高通量蛋白芯片技术筛选女性极端高骨密度组与极端低骨密度组血浆样本中差异表达的炎症因子,并利用ELISA实验技术在独立人群中对OP相关炎症因子进行验证和重复;第二章:利用细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡和细胞周期实验研究BLC蛋白对OP相关骨细胞的分子功能机制。第一章研究目的基于高通量蛋白芯片技术和ELISA实验技术系统筛选女性血浆中OP相关的潜在炎症因子生物标志物。研究方法基于一个包含6308名中国老年人群的研究队列,本研究采用极端取样策略,运用高通量蛋白芯片技术在极端高低骨密度组间筛选与OP相关的差异表达的炎症因子,并在两个独立人群中运用ELISA实验技术方法对差异表达的炎症因子进行验证和重复。研究结果在选取的9例女性极端高骨密度研究对象和9例女性极端低骨密度研究对象中筛选得到了8个OP相关的差异表达的炎症因子,其中IGFBP4和CD97在极端高骨密度组中上调,BLC、M-CSF、IL-17、IL-11、6ckine、OPN在极端高骨密度组中下调。考虑到8个炎症因子的表达水平和目前检测方法限制,本研究最终确定了BLC、IGFBP4和OPN三种炎症因子进行下一步研究。再在两个独立人群中分别选取39例和41例女性极端样本用来验证和重复这三种炎症因子是否与OP相关。验证和重复结果与芯片筛选结果一致,即BLC与OPN在极端高骨密度组中低表达,IGFBP4在极端高骨密度组中高表达。同时将这三种炎症因子与BMD值进行相关性分析,结果显示BLC蛋白和OPN蛋白与BMD呈负相关,而IGFBP4蛋白与BMD值呈正相关。研究结论本研究通过运用高通量蛋白芯片技术,共筛选到8个OP相关的差异表达的炎症因子,其中IGFBP4和CD97在极端高骨密度组中上调,BLC、M-CSF、IL-17、IL-11、6ckine、OPN在极端高骨密度组中下调。随后在两个独立人群中BLC、OPN和IGFBP4得到了验证和重复,且血浆BLC、OPN和IGFBP4水平与髋部BMD具有相关性。这些证据说明,BLC、OPN和IGFBP4对OP疾病的发生发展可能具有重要作用,可作为绝经后女性OP的潜在生物标志物。第二章研究目的基于第一章研究内容,本章内容主要研究BLC蛋白对OP相关骨细胞的生物学特性影响,来揭示BLC蛋白对OP的细胞分子作用机制。研究方法本研究选取MC3T3-E1细胞和RAW264.7细胞作为目标细胞。对于MC3T3-E1细胞,通过RTCA技术观察不同BLC浓度条件下细胞的增殖情况,通过ALP活性染色和实时荧光定量检测不同BLC浓度条件下细胞的分化情况,通过Annexin V/PI双染法研究细胞在不同BLC浓度条件下的凋亡变化情况,通过PI染色固定研究不同BLC浓度条件下细胞的生长周期过程。对于RAW264.7细胞,通过RTCA技术观察不同BLC浓度条件下细胞的增殖情况,通过TRAP染色和F-actin染色检测不同BLC浓度条件下细胞的分化情况,通过Annexin V/PI双染法研究细胞分化成的破骨细胞在不同BLC浓度条件下的凋亡变化情况。研究结果与空白组相比,MC3T3-E1细胞加入不同浓度的BLC蛋白后,细胞增殖受到明显抑制,细胞凋亡率显著增加,而细胞周期并没有发生明显的改变,成骨细胞分化早期的ALP活性被抑制,成骨细胞分化相关基因COL1A1、OCN m RNA的表达明显降低。对于RAW264.7细胞,与空白组相比,加入不同浓度的BLC蛋白后,细胞增殖明显被促进,RAW264.7诱导形成的破骨细胞数量明显增加,体积明显增大,细胞骨架结构更加完整,而破骨细胞的凋亡并未受到明显影响。研究结论BLC蛋白可能通过抑制成骨细胞的增殖、分化和促进成骨细胞的凋亡来抑制骨形成,通过促进前破骨细胞的增殖和破骨细胞的生成来促进骨吸收。这两种机制共同作用使骨量减少、骨密度下降,最终导致OP的发生。
【图文】：

检测原理,因子,炎症因子,激光扫描仪

女性血浆中骨质疏松症相关的炎症因子筛选荧光检测激光扫描仪例如 InnoScan 300 扫描信号，，采用 Cy3 或者绿色通2nm）仪器型号： InnoScan 300 Microarray Scanner厂家: Innopsys产地：Parc d'ActivitésActivestre ；31 390 Carbonne France扫描参数： WaveLengh：532nm； Resolution：10μm

血浆,骨密度,表达差异,蛋白

(mmol/L)3.99±0.40 3.91±0.78 5.24±0.90 5.02±0.892. 骨质疏松相关的血浆炎症因子验证2.1 血浆BLC蛋白在极端人群中的验证2.1.1 血浆 BLC 蛋白在高低骨密度组的表达差异结果表明，血浆 BLC 蛋白的表达水平在极端高骨密度组明显低于极端低骨密度组。ELISA 检测结果显示，血浆 BLC 蛋白浓度范围为 0.186pg/ml~60.534pg/ml。如图 1.2 所示，在验证组中，高骨密度组 BLC 蛋白水平低于低骨密度组（12.43±2.31pg/ml vs. 26.66±3.95pg/ml），且差异具有统计学意义（P=0.003）。同样，重复组的结果与验证组结果一致，高骨密度组 BLC 蛋白水平低于低骨密度组（15.23±1.99 vs.25.38±4.42pg/ml），且差异具有统计学意义（P=0.037）。为了扩大样本量，增加检验效能，我们将验证组和重复组混合在一起进行分析，差异更加显著（P<0.001）。由此可以得出，血浆 BLC 蛋白在高骨密度组下调。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R580

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