【摘要】：研究背景与目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种多病因的代谢疾病,以慢性高血糖为特点,伴随因胰岛素(Insulin)分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是与胰岛素抵抗、遗传易感性等密切相关的代谢应激性肝损伤,其主要病理表现是非酒精、病毒、药物引起的肝脏脂肪含量增高。2型糖尿病是血脂代谢紊乱的一种常见疾病,而脂肪肝与脂代谢密不可分,所以2型糖尿病与脂肪肝也存在一定的联系。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发病在2型糖尿病人群中非常普遍,大约有75%的2型糖尿病病人患有脂肪肝的临床特征。而糖尿病在引起脂肪肝的病因中排第3位,仅次于饮酒与肥胖。糖尿病患者体内的葡萄糖和脂肪酸不能被很好利用,脂蛋白合成也出现障碍,致使大多数葡萄糖和脂肪酸在肝脏内转变成脂肪,沉积在肝内,导致脂肪肝。NAFLD亦可引起2型糖尿病,二者的合并存在,对患者造成严重的身体损害,对社会产生巨大的经济负担。因此深入解析2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发生发展机制,具有深远的社会意义。研究表明,过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)广泛参与能量代谢的调控,PPARs有3个代表性成员:PPAR-α,PPAR-β/δ和PPAR-γ,它们在能量代谢中有着举足轻重的作用,但它们的活性表达谱不同。PPAR-α分子具有促进脂肪生成及分化、防止炎症形成、维持葡萄糖的体内动态平衡、增加胰岛素敏感性等作用,因此,PPAR-α与脂肪肝以及T2DM的发病机制之间具有相关性。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的催化作用下在胞嘧啶分子C5位上添加一个具有活性的甲基团变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的一种化学修饰方法。PPAR-α基因的甲基化是影响代谢性疾病发生发展的一个重要因素,然而,目前尚不清楚其是否影响脂肪肝和T2DM的进展。有动物实验结果显示,高脂喂养的大鼠产生肥胖后,内脏的毛细血管密度变小,血流量因此减少,脂肪细胞增生使得脂肪组织氧分压降低,从而导致脂肪组织缺氧而产生坏死与炎性浸润,浸润脂肪组织的巨噬细胞释放过量的炎性介质,如IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1、CRP,从而引发慢性炎症反应。目前尚不清楚这些炎症因子在T2DM合并NAFLD中的水平。直至今日,尚没有文献报导稳定的2型糖尿病合并NAFLD的模型,本研究中,我们构建2型糖尿病合并NAFLD大鼠动物模型,在动物模型中探索PPAR-αα基因甲基化在T2DM合并NAFLD动物模型的构建过程中是否发生变化,是否影响PPAR-αα蛋白的表达,并分析其甲基化水平与炎症因子IL-10、IL-6、TNF-α、TGF-β1和hs-CRP表达水平的相关性,并在临床标本中进行验证分析。研究方法:(1)通过高脂饲料加小剂量链脲佐菌素(streptozptocin,STZ)喂养雄性SD大鼠构建T2DM合并NAFLD的动物模型,观察其血脂指标总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),肝功能指标丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)以及血糖(Glu)、胰岛素(INS)水平的变化,通过HE染色评价肝脏组织的脂肪变性。(2)取对照组和模型组动物的尾静脉全血,提取全血DNA,用DNA甲基化试剂盒测定PPAR-αα基因启动子区域的甲基化水平。抽提两组动物肝脏组织总RNA,用qPCR法分析其中PPAR-α基因mRNA水平的表达情况。对两组动物肝脏组织进行蛋白质免疫印迹分析PPAR-αα蛋白的表达。用酶联免疫吸附(ELISA)法检测两组动物血清中炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、转化生长因子1(TGF-β1)、C反应蛋白(hs-CRP)的含量。用蛋白质免疫印迹法分析两组动物肝脏组织hs-CRP、TNF-αα、IL-6和TGF-β 1的蛋白表达量。(3)选32例正常(N组)和35例T2DM合并NAFLD患者(M组)作为受试者,清晨8:00空腹取静脉血,生化检测血清ALT、AST、TC、TG水平。用荧光定量PCR法检测两组受试者血液中hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β 1的表达水平。用ELISA方法分析两组受试者血液中hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β 1蛋白表达量。用qPCR方法分析两组血清PPAR-αα基因mRNA的表达水平。用ELISA方法分析两组血清中PPAR-αα蛋白的表达水平。对两组血清中PPAR-α的表达水平与炎症因子hs-CRP、TNF-α、IL-6,IL-10和TGF-β 1进行相关性分析。研究结果:(1)高脂饲料加小剂量STZ(30mg/kg)喂养雄性SD大鼠两周后,肝脏组织切片的HE染色结果显示模型组大鼠的肝细胞内部有大小不一的脂滴存在,并且呈现出了小泡性的病理性脂变。糖耐量检测结果异常。肝功能指标ALT、AST与血脂指标TC、TG水平均上升且具有统计学意义(P0.01);且肝质量以及肝指数水平进一步提高且要高于对照组(P0.01)。这些研究结果表明T2DM合并NAFLD的大鼠模型构建成功,可用于PPAR-α基因甲基化作用机制的研究。(2)对对照组和T2DM合并NAFLD模型组大鼠PPAR-α基因的甲基化程度进行检测,结果发现对照组、模型组PPAR-α基因启动子区域甲基化阳性率分别为10%和65%(P0.05)。模型组PPAR-α的mRNA和蛋白质的表达较对照组均下降。与对照组比较,模型组hs-CRP、TNF-αα、TGF-β1和IL-6水平升高,IL-10的水平降低(P值均0.01)。(3)M组(T2DM合并NAFLD患者)受试者血清中ALT、AST、TC、TG和LDL水平较N组(正常)受试者显著升高(P0.01),而HDL水平显著降低(P0.01)。M组受试者血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6和TGF-β1的mRNA表达水平明显高于N组受试者(P0.01),而IL-10表达则明显低于N组受试者(P0.01)。M组受试者血清中hs-CRP、TNF-α、IL-6和TGF-β1蛋白表达明显高于N组受试者(P0.01),而IL-10表达则明显低于N组受试者(P0.01),与RNA水平检测结果一致。M组受试者血清中PPAR-α基因的mRNA表达水平显著降低(P0.01)。M组受试者血清中PPAR-α蛋白表达明显低于N组受试者血清(P0.01)。结论:(1)通过病理和生化指标的分析,我们首先证实了高脂饲料加小剂量STZ(30mg/kg)可以诱发并成功构建与临床2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝一致的稳定大鼠动物模型,为该疾病发生机制和治疗方案的研究提供了工具。(2)T2DM合并NAFLD大鼠PPAR-α基因甲基化百分率明显升高,血清炎性因子表达增多,可能是2型糖尿病脂肪肝发生率升高的机制之一。(3)T2DM合并NAFLD患者PPAR-α蛋白表达下调,且患者的炎性因子表达异常较正常人群发生率高。在动物模型和临床血液标本中均证实,PPAR-αα基因的甲基化转录调控与该疾病过程中的炎症反应的产生密切相关,提示我们PPAR-αα基因的转录调控可能是控制DM合并NAFLD疾病进展的靶点之一。
【图文】：
逦山东大学博士学位论文逦逡逑附图表逡逑表２－１造模前后大鼠体重的比较（ｘ邋土ｓ）逡逑体重（ｇ）逡逑分组逦数量逦逡逑开始逦５周逦最后逡逑对照组逦２０逦１８９．４０±１４．２５逦２９５．邋０３±１２．４２逦３５９．６３±１３．５１逡逑模型组逦２０逦１９１．１２±１３＿３４逦３２７．４７±１１．６３＊逦３７６．３３±１４．５＊逡逑注：与对照组相比，Ｐ＜0．0５逡逑
图２－２造模前后大鼠血清中血脂各指标的变化情况逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ：对照组；Ｍｏｄｅｌ邋ｇｒｏｕｐ：模型组；ＴＣ：总胆固醇；ＴＧ：甘油三醋；ＨＤＬ－Ｃ：逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.1;R575.5
【参考文献】
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2596724
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