血管新生对糖尿病动脉粥样硬化、脂肪代谢功能紊乱的作用及机制研究

发布时间：2020-03-23 21:10

【摘要】：研究背景2型糖尿病大血管病变是许多糖尿病严重并发症的常见病理基础,如冠心病、脑卒中及周围血管疾病等。流行病学数据显示,约80%糖尿病患者最终会死于心血管疾病,粥样斑块破裂导致的急性冠脉综合征是糖尿病患者心血管事件的主要原因。然而,糖尿病患者冠状动脉病变严重以及易损斑块发生率高的机制尚未完全阐明,所以缺乏基于机制的治疗措施。近年来,有学者发现动脉粥样硬化斑块外膜滋养血管(Vasa Vasorum,VV)常出现,与斑块稳定性的变化有着密切关联;而炎症又是糖尿病状态下斑块外膜滋养血管新生的核心驱动因素之一。脂肪组织的慢性低度炎症作为2型糖尿病和动脉粥样硬化的共同根源之一,已日益得到关注和认可。但是功能失调的脂肪组织如何架起脂肪组织炎症和斑块外膜滋养血管病理性血管新生之间的桥梁,促进易损斑块的发生发展尚不清楚。基于上述背景,针对炎症的治疗策略可能有一定的治疗糖尿病动脉粥样硬化的效果。CANTOS Ⅲ 期临床研究证实 Canakinumab(Canakinumab 是人 IL-1β的单克隆抗体)可以在降脂药物治疗基础上进一步降低心肌梗死患者不良心血管事件的发生,为动脉粥样硬化的炎症假说首次提供了直接证据。但是,研究人员发现每1000名接受抗炎治疗的患者中约有一人死于致命性感染。并且既往关于炎症与动脉粥样硬化心血管病之间的关系的临床实验,结果均为阴性。动脉粥样硬化的抗炎治疗仍然是有争议的,并且预期效果不显著。究其原因可能是现在的研究大多局限于分析单一炎症因子的作用。因此,动脉粥样硬化斑块形成过程中细胞之间复杂信息的交流可能需要一个更加精确和多种致病因素整合的细胞间信息交流载体。近来研究发现exosomes因其携带多种核酸(mRNA、microRNA等)、蛋白质和脂质等信号分子,在细胞间信息交流方面具有重要作用。与单一炎症因子相比,exosomes能以更加有效的方式在细胞间传递信息。Exosomes上可携带不同的配体与不同的细胞表面受体结合,因此具有特异的细胞靶向性。其功能主要取决于分泌细胞的类型和不同状态,不同细胞分泌的exosomes的组成成分不尽相同,因而能够发挥不同的生物功能。脂肪细胞来源exosomes(Adipocyte-derived Exosomes,ADEs)其含有的蛋白表达谱、micrRNA谱和脂肪因子表达谱的含量多少与脂肪组织胰岛素抵抗相关。而胰岛素抵抗的ADEs(Insulin Resistance Adipocyte-derived Exosomes,IRADEs)可以通过引起机体炎症参与胰岛素抵抗发生发展,并且具有多种生物学功能,如诱导脂肪细胞成脂、免疫细胞的激活及血管新生等。另有报道,由脂肪基质细胞(adipose stromal cells,ADSCs)分泌的exosomes参与血管新生。但是IRADEs在动脉粥样硬化VV血管新生中的作用尚未见报道。在涉及血管新生的信号家族中,刺猬蛋白(HH)家族作用显著。HH是一种分子量19kDa的成形素,与受体细胞膜上的PTCH1受体结合后,解除对Smoothened(SMO)受体的抑制,激活转录因子 Gli1,Gli2 和 Gli3。Sonic hedgehog(SHH)是刺猬蛋白家族中表达最广泛的,活性最高的分子。新近研究证实了 SHH可诱导胚胎组织血管新生,而且SHH特异性分布于成年动物血管外膜组织区域并且能通过激活周细胞维持成年人冠脉血管网完整性。SHH蛋白由两个结构域组成:在氨基端的结构域和在羧基端的结构域,其中氨基端的结构域具有SHH蛋白的信号活性,而羧基端的结构域则具有自身蛋白水解酶活性及胆固醇转移酶功能,在SHH自身修饰过程中发挥作用。SHH蛋白的脂质修饰对于其信息传递至关重要。在细胞外亲水性的环境中,exosomes作为疏水性的SHH蛋白天然载体,是调控SHH蛋白分布和远距离作用的重要机制之一。进一步研究显示,SHH蛋白修饰的CD34+骨髓细胞来源的exosomes会增加心肌病变的血管新生和改善心功能。另一方面,成熟的脂肪细胞能分泌产生SHH蛋白,并且在肥胖状态下SHH的产生会增多。那么,IRADEs能否通过SHH信号蛋白促进VV血管新生?在上述背景下,我们建立了胰岛素抵抗脂肪细胞模型及2型糖尿病动脉粥样硬化ApoE--小鼠模型,观察IRADEs及其携带的SHH表达情况,以期探讨IRADEs是否通过SHH蛋白参与了糖尿病动脉粥样硬化斑块VV血管新生,加重斑块易损性。研究目的1.建立胰岛素抵抗脂肪细胞模型,观察IRADEs及其携带的SHH表达情况2.建立2型糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型,观察IRADEs对斑块VV血管新生、斑块负荷和易损性的作用;3.IRADEs携带的SHH在VV血管新生、斑块负荷和易损性中的作用。研究方法1.SHH蛋白沉默和过表达载体的构建:根据RNAi干扰技术原则,设计3对针对小鼠SHH基因的siRNA,经过筛选后,选择沉默效率最高的序列构建pAdxsi-GFP-SHH-shRNA腺病毒载体。根据小鼠SHH基因序列,设计合成引物,克隆小鼠SHH mRNA,PCR扩增SHH基因,构建含小鼠SHH基因的pShuttle-CMV-RED-SHH腺病毒过表达载体;2.胰岛素抵抗脂肪细胞模型的建立:应用鸡尾酒法(胰岛素、地塞米松及3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤)将3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞。然后,高糖(25mM)+高胰岛素(10nM)刺激成熟的脂肪细胞24h,建立脂肪细胞胰岛素抵抗模型;3.采用超速差速离心方法分离纯化IRADEs;采用透射电镜,nanosight和western blot等方法鉴定IRADEs;Exocet试剂盒定量不同脂肪细胞来源的IRADEs 数量;4.应用PKH26荧光染料标记IRADEs、鬼笔环肽标记人脐静脉内皮细胞(HUVECs)、CD31标记小鼠主动脉根部斑块内皮进行体内、体外示踪实验研究IRADEs在体内、体外的摄取情况;5.小鼠主动脉环出芽实验中培养不同处理的小鼠的胸主动脉环,观察IRADEs及SHH蛋白干预对小鼠胸主动脉环出芽数量的影响;6.通过Matrigel plug assay实验,观察IRADEs及SHH蛋白对血管新生的影响。苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色后基质胶栓中的细胞数量和免疫组化CD31标记新生血管阳性面积来定量血管新生情况;7.3周龄健康雄性ApoE-/-小鼠90只,禁食自由饮水12～16h后,进行腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT)。注射剂量为1.5g/kg。后随机分成两组:普通饮食组和高糖高脂组(DM)。普通饮食组喂食普通小鼠维持饲料;高糖高脂饲料(34.5%脂肪,17.5%蛋白,48%碳水化合物)。在小鼠9周龄时,再次进行IPGTT,对高糖高脂组中出现胰岛素抵抗的小鼠进行糖尿病造模:禁食自由饮水8～12h后,一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)85mg/kg,普通饮食组给予STZ缓冲液腹腔注射。在小鼠11周龄时,测随机血糖连续两次≥11.lmmol/L且出现多饮多食多尿体重不减轻的小鼠为2型糖尿病造模成功小鼠。在小鼠16周龄时,普通饮食组小鼠随机分为普通饮食组(Chow)、普通饮食IRADEs处理组(Chow+IRADEs)、普通饮食IRADEs敲减SHH组(Chow+IRADEssSHH-),糖尿病组小鼠随机分为糖尿病组(DM)、糖尿病IRADEs处理组(DM+IRADEs)、糖尿病IRADEs敲减SHH组(DM+IRADEsSHH-)组,分别进行尾静脉注射对应的IRADEs或IRADEs SHH-,每只小鼠每次注射IRADEs的绝对数量为l×l07个,每周打两次,连续打8周,对照组(Chow、DM)组注射相同体积的PBS溶液;8.分别于ApoE-/-小鼠24周龄时进行动脉超声检查,通过高分辨率显微超声技术测量主动脉弓、头臂干和颈总动脉的内中膜厚度(MT);9.对主动脉行大体油红O染色,分析各组小鼠的斑块负荷。主动脉根部连续切片分别行苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色、油红O染色以及苦味酸-天狼猩红特殊染色以观察斑块形态,检测主动脉根部斑块横断面面积、斑块内的脂质含量、胶原含量百分比。免疫组织化学染色检测斑块内巨噬细胞(MOMA-2)、平滑肌细胞(α-SMA)、滋养血管(Tomato lectin染色)、炎症因子肿瘤坏死因子 α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白介素 1β(Interlukine1β,IL-1β)、白介素 6(Interlukine6,IL-6)、血管内皮细胞生长因子 A(vascularendothelial growthfactor A,VEGF-A)、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和9(matrix metalloproteinase-2,MMP-9)的表达。采用以下公式计算斑块易损指数:斑块易损指数=(脂质含量百分比+巨噬细胞含量百分比)/(胶原含量百分比+平滑肌细胞含量百分比)。结果1.建立2型糖尿病ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型为了产生与人类糖尿病动脉粥样硬化疾病非常相似的非基因敲除糖尿病动物模型,单独高糖高脂饮食6周后可诱导胰岛素抵抗(Insulin Resistance IR),由腹腔注射糖耐量实验(IPGTT)检测小鼠糖耐量,然后联合STZ一次性注射可导致轻微的血糖升高和IR(p0.05)。在实验结束时,DM小鼠仍然显示升高的血糖,DM组平均体重明显高于正常小鼠p0.05)。小鼠24周龄时,经过IRADEs处理的小鼠糖耐量与对照组相比明显降低(p0.05),而敲除IRADEs上SHH后小鼠糖耐量无明显变化(p0.05)。2.建立胰岛素抵抗脂肪细胞模型与0h相比,高糖高胰岛素刺激分化成熟脂肪细胞24h后,脂肪细胞胰岛素受体底物1蛋白水平基本不变,而胰岛素受体底物1酪氨酸位点磷酸化显著减少,丝氨酸位点(ser307)磷酸化显著增多。说明高糖高胰岛素刺激24后,脂肪细胞出现胰岛素抵抗,表明我们成功构建了脂肪细胞胰岛素抵抗模型。3.IRADEs的分离和鉴定透射电镜以及免疫金标技术显示,IRADEs形态为呈现典型的杯状结构,并且SHH蛋白存在于IRADEs表面。Western blot显示,exosomes阳性指标CD63、TSG101在我们提取的IRADEs中表达,而阴性指标Calnexin和Grp94不表达,说明我们成功的从脂肪细胞上清中提取了纯度较高的IRADEs。与正常ADEs相比,IRADEs上SHH蛋白表达增多,而在脂肪细胞过表达或者敲除SHH蛋白后,IRADEs上SHH蛋白表达会相应增加或者减少。Exocet试剂盒测量exosomes数量,IRADEs 数量约为 7.5×109/ml。4.IRADEs能被人脐静脉内皮细胞和ApoE-/-小鼠斑块摄取体外摄取实验,用PKH26标记IRADEs,在3h时候即可观察到人脐静脉内皮细胞摄取IRADEs,延长IRADEs孵育时间,会发现更多IRADEs被内皮细胞摄取,人脐静脉内皮细胞细胞质中exosome增多。体内摄取实验,为研究斑块是否摄取IRADEs,通过尾静脉注射PKH26标记的IRADEs进入糖尿病ApoE-/-小鼠血液循环,取主动脉根部斑块,观察到IRADEs能被斑块内皮细胞(CD31标记)所摄取。5.离体水平IRADEs通过SHH蛋白促进血管新生Matrigel plug assay实验,通过统计HE染色血管新生的个数和免疫组化CD31阳性面积,结果显示,VEGF组的细胞数量最多,Control组最少,IRADEs和IRADEssSHH+组比 IRADEssHH-组明显增多,与 IRADEs 组比,IRADEsSHH+明显比IRADEs组多(p0.05)。免疫组化CD31阳性面积的表达模式和组间差异与上述一致。此外,我们通过小鼠动脉环实验观察了 IRADEs对血管新生的影响。VEGF组小鼠动脉环的出芽数量最多,对照组最少,IRADEs和IRADEsSHH+组比IRADEsSHH-明显增多(p0.05),与 IRADEs 组比,IRADEsSHH+组明显比 IRADEs组多(p0.05)。6.I RADEs通过SHH蛋白增加ApoE-/-小鼠斑块负荷:高分辨率小动物超声检测评估ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块负荷。与对照组(Chow组)相比,DM组主动脉弓、头臂干和颈动脉内中膜厚度显著增加(p0.05)。与DM组或者Chow组相比,DM+IRADEs或Chow+IRADEs组中ApoE-/-小鼠的主动脉弓、头臂干和颈动脉内中膜厚度显著增加(p0.05),而敲除IRADEs上的SHH 信号蛋白后,DM+IRADEsSHH-或 Chow+ IRADEssSHH-组与 DM+IRADEs 或Chow+IRADEs组相比,主动脉弓、头臂干和颈动脉内中膜厚度明显减少(p0.05)。组织病理学大体油红O和主动脉根部斑块横切面HE染色进一步证实,与Chow组相比,DM组大体斑块相对面积和横断面斑块面积显著增加(p0.05)与DM或Chow组相比,DM + IRADEs或Chow + IRADEs组的大体斑块相对面积和横断面斑块面积显着增加(p0.05),DM + IRADEsSHH-或Chow + IRADEsSHH-组与DM + IRADEs或Chow + IRADEs组相比大体斑块相对面积和横断面斑块面积明显降低(p0.05)。7。IRADEs通过SHH蛋白增加ApoE-/-小鼠主动脉根部斑块易损指数以及主动脉根部斑块外膜滋养血管新生病理染色结果显示,与其所对应的对照组(即Chow和DM组)相比,IRADEs处理组主动脉斑块内脂质及巨噬细胞含量百分比明显增多,而敲减IRADEs上SHH蛋白后,斑块内脂质及巨噬细胞含量百分比明显减少。说明IRADEs通过SHH蛋白能增加斑块内脂质及巨噬细胞百分比含量;与其所对应的对照组(即Chow和DM组)相比,IRADEs处理组主动脉根部斑块内平滑肌及胶原含量百分比明显减少,而敲减IRADEs上SHH蛋白后,斑块内平滑肌及胶原含量百分比明显明显增多。说明IRADEs通过SHH蛋白能减少平滑肌及胶原含量;根据公式计算各组斑块易损指数,与其所对应的对照组(即Chow和DM组)相比,IRADEs处理组易损指数显著增加,而敲减exosome上SHH蛋白后,斑块易损指数明显减少。说明IRADEs通过SHH蛋白能增加斑块内易损指数。我们检测了小鼠斑块血管外膜滋养血管新生情况。与Chow组相比,DM组中血管外膜滋养血管数量明显增多。与DM组或者Chow组相比,DM+IRADEs或Chow+IRADEs组血管外膜滋养血管数量明显增多(p0.05),而DM+IRADEsSHH-或 Chow+IRADEsSHH-组与 DM+IRADEs 或 Chow+IRADEs 组相比明显减少(p0.05)。8.I RADEs通过SHH蛋白增加ApoE-/-小鼠主动脉根部斑块血管新生相关蛋白水平表达免疫组化及western blot结果显示,与Chow组相比,DM组中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素 6(IL-6)、IL-1β、ICAM-1、血管新生因子 VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平显著增加。与DM或Chow组相比,DM + IRADEs或Chow+ IRADEs 显著增加了 TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1、VEGF-A、MMP-2 和 MMP-9蛋白表达水平,而在 DM + IRADEsSHH-或 Chow + IRADEsSHH-组中 TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1、VEGF-A、MMP-2和MMP-9蛋白水平表达显著减少。结论1.胰岛素抵抗的IRADEs上SHH蛋白表达增多,IRADEs能被人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和小鼠斑块内皮细胞摄取2.IRADEs显著增加小鼠体内Matrigel基质胶栓和主动脉环出芽实验的血管新生反应3.IRADEs显著增加斑块VV血管新生,促进斑块血管新生相关因子的表达,可能是其促进2型糖尿病ApoE-/-小鼠斑块负荷和易损性增加的重要机制,SHH蛋白介导了 IRADEs上述效应研究背景脂肪组织被认为是胰岛素抵抗(Insulin Resistance IR)发生发展的主要部位之一。脂肪组织的生长和功能依赖于血管新生,所以脂肪组织血管新生是一个非常有希望治疗肥胖及其相关代谢性疾病的靶点。已经证实,血管新生(Angiogenesis)可以通过调节脂肪形成和能量平衡来促进或改善IR。脂肪组织由白色脂肪组织(White Adipose Tissue,WAT)和棕色脂肪组织(Brown Adipose Tissue,BAT)组成。以往的研究仅关注WAT或BAT血管新生对IR的作用。同一机体不同的脂肪组织血管新生在IR中的作用仍不清楚。脂肪组织血管新生与IR密切相关。WAT中的肥大的脂肪细胞可以分泌促血管新生因子,促进血管新生,血管新生的增多会进一步促进脂肪细胞肥大,形成恶性循环,加重IR。在代谢活动活跃的BAT中,血管新生可增加能量消耗并改善IR。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)——核激素受体超家族成员,在脂肪组织中高表达。PPARγ激动剂具有血管保护作用,能够抑制动物模型和人类糖尿病的血管炎症和动脉粥样硬化进展。重要的是,它们在体外和体内具有调节血管新生的作用。PPARy存在于内皮细胞中,多项研究表明激活PPARy可抑制体外内皮细胞增殖并分化为管状结构。其抗血管新生机制包括抑制Akt磷酸化,抑制VEGF受体-1(Flt-1)和2(Flk/KDR)、上调血小板反应蛋白受体CD36表达。CD36是一种涉及血管新生、动脉粥样硬化、炎症和脂质代谢的B类清道夫受体。尽管CD36的配体凝血酶敏感蛋白-1(Thrombospondin 1 TSP-1)可以通过非CD36依赖的途径来抑制血管新生,但其主要的抗血管新生的作用仍然要依靠CD36信号通路。CD36的在大血管上较少表达,在某些动脉上不表达,主要在微血管上表达。PPARy能够上调多种正常及肿瘤组织中CD36的表达,是CD36表达的关键。已有文章证实PPARγ通过CD36诱导内皮细胞凋亡STAMP2是一种六次跨膜蛋白,属于STAMP或STEAP家族。具有抗炎、维持正常葡萄糖耐量,脂质代谢和改善IR等作用。有研究证实,STAMP2基因缺陷小鼠在正常饮食条件下也会引起自发性代谢综合征,胰岛素抵抗,糖代谢紊乱,高血压和脂肪肝等疾病。其不同部位的脂肪组织中STAMP2的缺乏程度不同,内脏脂肪和棕色脂肪STAMP2的缺乏要比皮下脂肪显著。最近的研究表明,STAMP2缺乏可引起脂肪组织中促血管新生因子的分泌增加,但是STAMP2在脂肪组织中对血管新生的影响及其机制尚不清楚。干扰STAMP2表达抑制脂肪形成是通过减少PPARγ的表达来实现的。然而,STAMP2是否通过PPARγ/CD36信号通路调节脂肪组织的血管新生还有待进一步研究。因此本研究提出如下假说,STAMP2通过PPARy/CD36信号通路参与调控了糖尿病脂肪组织中血管新生过程。为了研究STAMP2对糖尿病小鼠不同脂肪组织中血管新生的影响,我们建立了 2型糖尿病ApoE-/-LDLR-/-小鼠模型。研究STAMP2基因过表达对不同部位脂肪组织中血管新生的影响,并以人脐静脉内皮细胞为模型研究STAMP2对内皮细胞迁移、管型形成的作用及对PPARγ/CD36信号通路的影响。研究目的1.观察糖尿病动物模型中STAMP2对脂肪组织血管新生的影响2.体外水平探讨STAMP2对HUVECs迁移、管型形成以及血管新生相关因子表达的影响3.阐明STAMP2通过激活PPARγ/CD36信号通路调控血管新生研究方法1.动物实验部分:(1)建立2型糖尿病ApoE--LDLR-/-小鼠模型:3周龄健康雄性ApoE-/-LDLR-/-小鼠90只,禁食12～16h后,进行腹腔葡萄糖耐量实验(IPGTT)。注射剂量为1.5mg/kg。后随机分成两组:普通饮食组和高糖高脂组(DM)。普通饮食组喂食普通小鼠维持饲料;高糖高脂饲料)。在小鼠9周龄时,再次进行IPGTT,对高糖高脂组中出现胰岛素抵抗的小鼠进行糖尿病造模:禁食自由饮水8～12h后,一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)85mg/kg,普通饮食组给予STZ缓冲液腹腔注射。在小鼠11周龄时,测随机血糖连续两次≥11.1mmol/L且出现多饮多食多尿体重不减轻的小鼠为2型糖尿病造模成功小鼠。各组以原饲料维续喂养。9周后分别经尾静脉注入腺病毒5×109PFU/只;各组继续喂以原饲料4周。当两组小鼠20周龄时,将普食组随机分为:普食+空载体组(Control+Vehicle)和普食+ STAMP2过表达组(Control +STAMP2),糖尿病组(DM)随机分为:糖尿病+空载体组(DM+Vehicle)和糖尿病+STAMP2过表达组(DM+STAMP2),各组小鼠经颈静脉注射STAMP2过表达腺病毒或空载体腺病毒。两周后,再次以相同剂量的通过颈静脉将过表达腺病毒和空载体腺病毒注入小鼠体内。在24周龄时处死小鼠,并保存附睾脂肪、皮下脂肪和棕色脂肪;(2)小鼠体重的称重:监测小鼠体重的变化并记录数据;(3)小鼠生化指标监测:实验结束时心尖取血,分离胶促凝管离心后分别监测空腹血清甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、游离脂肪酸(FFA)的水平;(4)病理性检测:对附睾、皮下及棕色脂肪组织分别进行HE染色;通过免疫组织化学染色的方法检测脂肪组织内血管新生(标记物为endomucin和CD31);(5)Western Blot检测:提取新鲜的附睾、皮下及棕色脂肪组织并提取蛋白,观察脂肪组织STAMP2、PPARy及CD36蛋白表达水平。2.主动脉环出芽实验在Matrigel基质胶中培养小鼠胸主动脉环,观察过表达STAMP2后对小鼠胸主动脉环出芽的影响。3.细胞实验部分:(1)将人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)分为对照干扰组(siRNA-NC)、STAMP2 干扰组(siRNA-STAMP2)、STAMP2干扰+罗格列酮组(siRNA-STAMP2 + RSG)、空载体组(Ad-NC)、STAMP2过表达组(Ad-STAMP2)和 STAMP2 过表达+GW9662 组(Ad-STAMP2 +GW9662);(2)内皮细胞迁移能力实验检测:分别采用划痕实验和Transwell小室迁移实验来观察STAMP2对内皮细胞迁移能力的影响(3)体外血管新生实验:于含低生长因子基质胶(Matrigel)中,观察STAMP2对内皮细胞体外血管新生的影响。(4)Western Blot 检测I HUVECs 中 STAMP2、PPARγ 及 CD36 蛋白表达水平。(5)RT-PCR 检测 STAMP2 对血管新生相关因子(VEGF-A、VCAM-1、ICAM-1、Flt-1、CD36)mRNA 表达的影响。结果1。建立2型糖尿病ApoE-/-LDLR-/-小鼠模型(1)IPGTT实验结果显示:在3周龄时,普食组与糖尿病组ApoE-/-LDLR-/-小鼠的血糖水平无显著统计学差异(p0.05);经过6周高脂饮食后,与普食组ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,糖尿病 ApoE-/-LDLR-/-小鼠在 15min、30min、60min 及120min血糖水平显著增加,血糖曲线下面积显著增加(p0.05);11周龄时,与对照组 ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,糖尿病 ApoE-/-LDLR-/-小鼠在 Omin、15min、30min、60min及120min血糖水平显著增加,血糖曲线下面积显著增加(p0.05);(2)与对照组ApoE-/LDLR-/-小鼠相比,糖尿病ApoE-/-LDLR-/-小鼠在9周龄、20周龄、22周龄及24周龄时体重显著增加。2.STAMP2过表达改善了 2型糖尿病ApoE-/LDLR-/-小鼠糖耐量受损(1)实验结束时,与普食组ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,糖尿病ApoE-/-LDLR-/-小鼠及糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/-LDLR-/-小鼠体重均显著增加(p0.05);糖尿病+空载体组ApoE-/-LDLR-/-小鼠与糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/-LDLR-/-小鼠体重无显著统计学意义(p0.05)。(2)IPGTT实验显示,与糖尿病+空载体组ApoE--LDLR/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2 过表达组 ApoE-/-LDLR-/-小鼠在 Omin、15min、30min、60min 及 120min血糖水平显著降低,血糖曲线下面积显著降低(p0.05)。结果表明STAMP2的过表达提高了了糖尿病ApoE-/-LDLR-/-、鼠糖耐量,改善了胰岛素抵抗。3.STAMP2过表达对2型糖尿病ApoE--LDLR-/-小鼠脂肪组织形态的影响与普食组ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,糖尿病组ApoE-/-LDLR-/-小鼠附睾与皮下脂肪细胞显著增大,棕色脂肪组织存在脂质空泡,有棕色脂肪白色变现象。与普食+空载体组ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,普食+STAMP2过表达组ApoE-/-LDLR--小鼠附睾脂肪细胞显著减小,皮下脂肪细胞大小无明显差异,棕色脂肪组织脂质空泡明显减小,棕色脂肪白色变现象被逆转。与糖尿病+空载体组ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2过表达组ApoE--LDLR-/-小鼠附睾脂肪细胞显著减小,皮下脂肪细胞大小无显著性差异,棕色脂肪组织中脂质空泡显著减小,逆转棕色脂肪白色变现象。4.STAMP2过表达对2型糖尿病ApoE-/-LDL-/-小鼠脂肪组织血管新生的影响与普食组ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,糖尿病ApoE-/-LDLR-/-小鼠附睾,皮下及棕色脂肪组织中血管新生显著增加;与普食+空载体组ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,在普食+STAMP2过表达组ApoE-/-LDLR-/-小鼠附睾与棕色脂肪组织中血管新生显著降低。皮下脂肪组织中血管新生无显著差异。与糖尿病+空载体组ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,糖尿病+STAMP2过表达组ApoE-/-LDLR-/-小鼠附睾与棕色脂肪组织中血管新生显著降低。皮下脂肪组织中血管新生无显著差异。5.STAMP2过表达对2型糖尿病ApoE--LDLR-/-小鼠脂肪组织中PPARγ/CD36信号通路的影响与普食+空载体组ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,PPARγ/CD36表达水平在普食+STAMP2过表达组ApoE-/-LDLR-/-小鼠附睾脂肪组织和棕色脂肪显著升高。皮下脂肪中PPARγ/CD36表达水平无明显变化。与糖尿病+空载体组ApoE-/-LDLR-/-小鼠相比,在糖尿病+STAMP2过表达组中,ApoE-/-LDLR-/-小鼠附睾脂肪组织和棕色脂肪中PPARγ/CD36表达水平升高。皮下脂肪中PPARγ/CD36表达水平无明显差异。6.STAMP2对主动脉环出芽能力的影响离体主动脉环出芽实验表明,STAMP2过表达显著抑制主动脉环出芽数量7.STAMP2对HUVECs迁移能力、体外成管能力的影响细胞划痕实验结果显示,与siRNA-NC组相比,siRNA-STAMP2组中迁移率显著升高,这种作用被PPARγ激动剂RSG减弱;Ad-STAMP2组的细胞迁移率显着低于Ad-NC组,这种作用被PPARyGW9662减弱。Transwell小室迁移进一步证实了 STAMP2对HUVECs迁移的这种作用。与siRNA-NC组相比,siRNA-STAMP2组的细胞体外成管能力增强,这种作用被RSG减弱;Ad-STAMP2组的细胞体外成管能力显着低于Ad-NC组,这种作用被GW9662减弱。8.STAMP2对HUVECs中PPARγ/CD36信号通路及血管新生相关因子表达的影响Western blot检测结果显示,过表达STAMP2可以激活PPARγ/CD36信号通路,PPARγ/CD36蛋白表达水平显著升高,这种效应可以被PPARγ抑制剂GW9442削弱。干扰STAMP2基因表达后,PPARγ/CD36信号通路受抑制,PPARγ/CD36蛋白表达水平显著降低,这种效应可被PPARγ激动剂RSG所逆转。RT-PCR结果显示干扰STAMP2基因表达后,VEGF-A、VCAM-1、ICAM-1表达增多,CD36表达减少,这种效应可被PPARγ激动剂RSG所逆转;过表达STAMP2可以显著抑制VEGF-A、VCAM-1、ICAM-1表达,增加CD36表达,这种效应可以被PPARγ抑制剂GW9442削弱。结论1.STAMP2可调控HUVECs迁移、成管、血管新生相关因子(VEGF-A、VCAM-1、ICAM-1、CD36)的表达2.过表达STAMP2显著减少糖尿病小鼠附睾脂肪和棕色脂肪的血管新生,相应的附睾脂肪细胞显著变小,棕色脂肪脂质空泡显著减少,提示过表达STAMP2可能通过减少脂肪组织血管新生改善脂肪组织代谢紊乱,这一过程是通过激活脂肪组织中PPAR γ/CD36信号通路实现的STAMP2通过PPARγ/CD36信号通路参与调控了糖尿病脂肪组织中血管新生过程。
【图文】：

周龄,动脉粥样硬化模型,小鼠,曲线下面积

图１邋Ａｐ0Ｅ＋小鼠糖尿病动脉粥样硬化模型的建立逡逑（Ａ）逦３，９和１１周时不同组ＡｐｏＥ＿Ｍ、鼠糖耐量分析逡逑（Ｂ）逦３，９和１１周龄的ＡｐｏＥ＾小鼠的曲线下面积逡逑（Ｃ）在３，９，，１１，２０，２２和２４周龄时ＡｐｏＥ＿／＿小鼠的体重逡逑（Ｄ）逦２４周龄ＡｐｏＥ＿／＿小鼠的糖耐量分析。逡逑ｐ＜０．０５邋ｖｓ．邋Ｃｈｏｗ；邋＾＜０．０５邋ｖｓ．邋ＤＭ．逡逑６２逡逑

脂肪细胞,胰岛素抵抗模型,油红,抗体

图２脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立并且ＳＨＨ蛋白存在于丨ＲＡＤＥｓ上逡逑（Ａ）逦ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋检测邋ＩＲＳ－１邋和邋ＩＲＳ－１邋磷酸化（Ｓｅｒ３０７）水平．＊ｐ＜０．０５邋ｖｓ．Ｏｈ邋组；逡逑（Ｂ）成熟的脂肪细胞油红Ｏ染色；逡逑（Ｃ）免疫金标电镜图（抗体为抗ＳＨＨ抗体）；逡逑（Ｄ）逦ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋检测邋ＩＲＡＤＥｓ邋上邋ＳＨＨ邋表达情况逡逑＾Ｏ－ＯＳ邋ｖｓ．Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ，邋＃ｐ＜０．０５邋ｖｓ．ｖｅｈｉｃｌｅ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑６３逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2

【参考文献】