哮喘肥大细胞IL-18、嗜碱性粒细胞IL-18和树突状细胞TLR4表达的变化及其临床意义研究

发布时间：2020-03-26 16:12

【摘要】：目的:支气管哮喘(Bronchial asthma)是由气道炎症细胞(如树突状细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等)、结构细胞(如气道上皮细胞)和细胞组分共同参与的气道慢性炎症性疾病。当过敏原进入气道后,即被抗原呈递细胞捕获,呈递给CD4+T细胞。抗原呈递的最重要条件是在呈递部位有IL-4以及某些决定T细胞分化为Th2细胞的辅助受体的参与。Th2细胞产生IL-4、IL-3和IL-5等细胞因子,其中IL-4和IL-3诱导浆细胞产生IgE,通过高亲和性受体FcεRⅠ结合到肥大细胞和嗜碱性粒细胞上。当相应抗原与IgE结合时,会产生一个激动信号使细胞(主要是肥大细胞)活化,导致各种化学介质的释放。组胺和LTs等生化介质可引起局部组织效应,包括气道平滑肌收缩、组织水肿、黏液分泌增加和神经刺激症状等,最终导致搔痒和打喷嚏。IL-18是IL-1家族中一种多效促炎性细胞因子,在固有免疫和适应性免疫中起重要作用。研究发现IL-18变异与哮喘严重程度显著相关。IL-18和IL-18R在致命性哮喘患者肺内强烈表达,提示IL-18在哮喘中起作用。另一方面,哮喘尤其是难治性哮喘患者的痰液上清液中IL-18水平明显低于正常人,这种变化与巨噬细胞的数目成正比,与中性粒细胞的百分比成反比,与嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)和嗜酸性粒细胞不相关。为了进一步了解IL-18在哮喘中的潜在作用,在本研究中我们检测了血液嗜碱性粒细胞和痰液肥大细胞中IL-18、IL-18BP和IL-18R的表达。研究发现,链格孢提取物诱导培养后,正常人支气管上皮细胞迅速释放IL-18并通过NF-κB依赖途径直接启动幼稚CD4+T细胞的Th2极化。还有研究发现IL-18与肥大细胞和嗜碱细胞分泌IL-13相关,提示过敏原可能通过IL-18引起过敏性气道反应,而IL-18能够影响肥大细胞和嗜碱性粒细胞的功能。由于肥大细胞和嗜碱性粒细胞是哮喘中的关键细胞类型,它们可以产生一系列不同的细胞因子,因此它们可能是IL-18的主要来源。通过研究IL-18、IL-18BP和IL-18R的相关机制,我们研究了肥大细胞和嗜碱性粒细胞在哮喘中的潜在作用,并进一步探究了IL-18相关机制在哮喘发病中的作用。由于嗜碱性粒细胞的数目极少,我们将通过树突状细胞(Dendritic cells,DCs)进一步研究IL-18等细胞因子分泌的机制。DCs是哮喘发病的始动者,能够驱使CD4+幼稚型T细胞活化并向Th2细胞分化,在维持免疫反应和免疫耐受方面发挥关键的作用。DCs细胞监视环境的受体有多种,包括Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)。LPS是TLR4受体激动剂,同时也是实验和临床上的高效佐剂之一。TLR4受体不同于其他的TLR受体,它的下游信号可以通过两个独立的通路传导。第一个通路依赖于MyD88转接蛋白。MyD88信号通路在促炎性因子(如IL-6和TNF-α)释放中有非常重要的作用,但研究发现共刺激分子的上调是不需要MyD88信号通路的,由此发现了第二个通路MyD88非依赖性信号通路,这个通路依赖于TRIF转接蛋白。先前的研究表明TRIF对LPS激活后共刺激分子的上调非常关键,在这篇文章中,共刺激分子上调被认为是IFN-I受体通路的结果。然而,这篇文章主要是观察巨噬细胞的,DCs细胞是否通过同样的机制产生同样的结果,我们不得而知。在本实验中,我们将探究DCs细胞识别尘螨过敏原是通过MyD88信号通路完成的还是通过TRIF通路完成的还是二者缺一不可,以及是通过哪些信号分子来触发NF-κB的,分泌了哪些细胞因子群,为揭示树突状细胞参与HDM诱导的免疫应答提供新的依据,为哮喘及其他相关过敏性疾病的发病机制提供新的理论基础。研究方法:第一部分:本研究共招募了31名哮喘患者和14名健康对照(HC)受试者。入院收集哮喘患者(急性加重阶段)的血液,门诊收集HC受试者的血液,每个个体抽取10 mL外周血置于EDTA管中。哮喘患者深度咳嗽排痰,无菌杯收集痰液,每名患者至少收集5毫升痰液。流式细胞术分析人嗜碱性粒细胞和肥大细胞IL-18、IL-18BP和IL-18R的表达,检测哮喘患者痰液中肥大细胞IL-18、IL-18BP和IL-18R的表达。BALB/c小鼠(5-6 w,18-22 g)小鼠在第0、7、14和21天皮下多点注射OVA溶液(含OVA 50μg、Al(OH)_3 1.5 mg)。于第25天,致敏小鼠气管内注射0.1 mL 5%OVA溶液(含或不含10 ng/m L IL-18)3小时,然后单侧肺注入1 m L的生理盐水(含有1 mM EDTA)2 min,收集支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。摘除眼球收集小鼠血液,颈椎脱臼法处死小鼠,消化肺组织,流式细胞术分析小鼠外周血嗜碱性粒细胞IL-18、IL-18BP和IL-18R的表达,检测小鼠BALF和肺组织中肥大细胞IL-18BP、IL-18R的表达,夹心ELISA检测小鼠血浆IL-18BP的水平。第二部分:收集健康对照和HDM+哮喘患者血清,利用CD14+免疫磁珠从人外周血分选CD14+单核细胞,诱导分化成DCs细胞。用健康对照血清、哮喘患者血清孵育DCs细胞,LPS作为阳性对照,孵育24h。收集DCs细胞,ELISA检测DCs细胞上清IL-6的分泌情况。Western blot观察TLR4、TLR2、MyD88、MAPKs和NF-κB的表达变化。结果:第一部分:1.HC和哮喘血液中约53%和51%的嗜碱性粒细胞表达IL-18,HC和哮喘血液中超过85%和81%嗜碱性粒细胞表达IL-18BP。然而,HC和哮喘血液中只有19.8%和8.6%的嗜碱性粒细胞表达IL-18R,与HC血液相比哮喘患者血液中IL-18R+嗜碱性粒细胞减少56.4%;2.CD34-FcεRIα+CD117+肥大细胞仅由约0.39%分散的有核细胞组成,仅有3.5%、14.3%和2.4%表达IL-18、IL-18BP和IL-18R。3.致敏小鼠血液中的IL-18BP+嗜碱细胞比例明显下降,但IL-18R+嗜碱性细胞显著增加;4.致敏和IL-18增加了BALF中肥大细胞的数量,IL-18增强了IL-18BP+肥大细胞的表达;5.IL-18增强了OVA致敏小鼠肺中肥大细胞的数量和IL-18R+肥大细胞的百分比;6.IL-18注射使非致敏和OVA致敏小鼠的血浆中的IL-18BP水平分别增加48.0%和16.1%。第二部分:1.在HDM+哮喘患者血清的微环境下,MDDC细胞通过TLR4来识别HDME。2.单独的HDM+哮喘患者血清即可刺激MDDC细胞MyD88表达增加,在血清中加入高剂量的HDME,MDDC细胞MyD88表达变化更为明显。3.健康血清和哮喘血清均导致MDDC细胞中ERK、p38的磷酸化增加。4.HDM+哮喘患者血清对MDDC有作用,促进NF-κB的易位。5.AS plasma+HDME 10组MDDC细胞IL-6分泌升高,SB203580和U0126均抑制了MDDC细胞IL-6的分泌。结论:第一部分:1.人外周血中50%嗜碱性粒细胞表达IL-18,80%嗜碱性粒细胞表达IL-18BP,嗜碱性粒细胞参与哮喘的发病与IL-18无关。2.哮喘患者痰液中仅有0.39%的有核肥大细胞,IL-18+肥大细胞比例降低,导致哮喘痰液中IL-18水平降低。3.致敏对小鼠肺组织肥大细胞的数目、肥大细胞IL-18BP和肥大细胞IL-18R的表达没有影响。4.外源IL-18增强OVA致敏小鼠BALF和肺组织中肥大细胞以及IL-18R+肥大细胞的数目,肥大细胞通过IL-18相关机制参与哮喘的发病。第二部分:1.过敏性哮喘血清和MDDC细胞共培养可以模拟整体情况下的DCs细胞在哮喘微环境中的变化。2.HDME激活MDDC细胞TLR4信号通路,可能通过MyD88/ERK/p38/NF-κB信号通路诱导炎症反应。
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中国医科大学博士学位论文一直被用于哮喘治疗。抗 TNF-α，IL-4，，IL-5 和 IL-13 治疗哮喘在部分临床试验中已取得成功，然而，这些疗法并非适用于所有哮喘患者。此外，后期恶性肿瘤风险的增加以及其他不良事件的出现引起了人们对于生物试剂的质疑。因此，需要继续寻找新的细胞因子以代替目前的治疗方向。

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图 3.1 哮喘患者和 HC 受试者外周血嗜碱性粒细胞 IL-注：HC：健康对照：Asthma：哮喘。（A）代表白细胞嗜碱性粒细胞的画门。（B）显示加或者不加外周血白细胞中 CD123+HLA-DR-CCR3+嗜碱性粒细胞的比IL-18、IL-18BP 和 IL-18R 的画门。（D）显示 IL-18+、IL-18例。（E）代表 IL-18+（a）、IL-18BP+（a）和 IL-18R+（a）嗜的代表性流式细胞图像。（E）显示 IL-18+、IL-18BP+和 IL-1病人（n = 31）和 HC 受试者（n = 14）的箱式图，图中展示了间距、最大值和最小值。*代表与 HC 组相比（P <0.05）（配对3.2 哮喘患者痰液肥大细胞 IL-18、IL-18BP 和与血浆不同[15]，哮喘患者痰液中 IL-18 水平低于是哮喘中的关键细胞类型之一[33]，可以产生一系列不
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R562.25

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