miR-27a通过下调FoxO1促进肥胖胰岛素抵抗β细胞胰岛素分泌的作用机制研究

发布时间：2020-03-31 13:25

【摘要】：肥胖胰岛素抵抗是发展为2型糖尿病的关键诱因之一。在肥胖早期,胰岛β细胞代偿性分泌胰岛素增多以平衡内环境血糖稳态,导致血中胰岛素水平明显升高。随着病程延长,胰岛β细胞持续超负荷工作步入失代偿期,最终导致T2DM时胰岛β细胞功能衰竭。因此阐明β细胞过度分泌胰岛素,加速失代偿进程的调控机制对于T2DM早期预防及治疗有着重要意义。近年来,调控着复杂分子网络的microRNAs(miRNAs)受到了广泛的关注,其中多种miRNAs被证实参与β细胞功能的调控。课题组前期研究表明,在众多的miRNA中,miR-27a与肥胖胰岛素抵抗的发生发展密切相关,参与了肥胖代谢综合征以及2型糖尿病中多个糖脂代谢靶器官胰岛素抵抗的发生。但miR-27a对肥胖胰岛素抵抗模型中胰岛β细胞过度分泌胰岛素的影响尚不清楚。通过基因预测及在Targetscan等网站的生物信息学分析结果显示,miR-27a与胰岛β细胞关键核转录因子FoxO1的3’UTR端具有高度互补的结合位点。同时多种组织细胞中的荧光素酶报告基因结果显示,miR-27a可以与FoxO1的mRNA结合抑制Fox O1的转录,提示Fox O1可能是miR-27a的潜在靶点。Fox O1为叉头框架蛋白Fox家族的一员,在胰岛β细胞中高表达,作为核转录因子参与调控胰岛β细胞多种生理功能。研究表明,FoxO1可以与PDX1启动子结合负向调控其转录过程,而PDX1是调控胰岛素合成的胰岛特异关键蛋白之一。同时,PDX1在基因水平上可以促进β细胞特异性葡萄糖转运子GLUT2和游离脂肪酸受体GPR40表达。而GLUT2及GPR40在葡萄糖刺激及中长链游离脂肪酸刺激的胰岛素分泌过程中发挥着重要作用。由此可见,FoxO1表达下调后能够促进PDX1的表达,而PDX1能够一方面参与胰岛素合成,一方面通过上调葡萄糖转运子GLUT2及脂肪酸受体GPR40增加胰岛素分泌,而在胰岛素抵抗状态下胰岛β细胞过度分泌胰岛素可能会加速胰岛β细胞的衰竭,进而推动肥胖诱导2型糖尿病发生。鉴于课题组前期研究结果表明miR-27a参与肥胖胰岛素抵抗的发生,而Fox O1是其重要的下游调控靶点,我们推测在肥胖胰岛素抵抗过程中,miR-27a影响胰岛β细胞过度分泌胰岛素的调控机制可能是通过Fox O1-PDX1-GLUT2/GPR40通路完成的。实验目的:本课题通过建立长期高脂饮食喂养的肥胖胰岛素抵抗小鼠模型以及高脂饮食喂养miR-27a慢病毒沉默小鼠模型,观察mi R-27a对肥胖诱导胰岛素抵抗下β细胞过度分泌胰岛素的影响;通过在MIN6细胞中过表达miR-27a及Fox O1,阐明miR-27a通过FoxO1促进胰岛素分泌的分子机制。实验方法:1.整体水平探讨miR-27a在肥胖胰岛素抵抗β细胞过度分泌胰岛素中的作用:建立高脂喂养肥胖胰岛素抵抗小鼠模型,检测生理生化指标、OGTT、ITT确定小鼠肥胖及胰岛素抵抗情况;GSIS、胰岛组织学染色和胰岛素免疫组化确定β细胞形态及功能变化;建立miR-27a慢病毒沉默高脂喂养小鼠模型,ELISA试剂盒检测空腹胰岛素水平;RT-PCR法检测肥胖胰岛素抵抗小鼠及miR-27a慢病毒沉默小鼠胰岛组织中的miR-27a和Fox O1水平;Western blot法检测FoxO1及与β细胞增殖及胰岛素合成分泌相关蛋白PDX1、GLUT2、GPR40的表达情况。2.细胞水平阐述miR-27a通过调控FoxO1在β细胞过度分泌胰岛素中的分子机制:通过转染的方法将MIN6细胞分为三组:对照组、过表达miR-27a组、miR-27a联合Fox O1同时过表达组。使用荧光显微镜通过拍摄不同的荧光颜色鉴定转染效率;通过胰岛素ELISA试剂盒检测基础水平及葡萄糖短时刺激分泌的胰岛素水平;ATP检测试剂盒检测细胞中ATP水平;RT-PCR法检测miR-27a、FoxO1、PDX1、GLUT2、GPR40的mRNA表达情况;Western blot法检测FoxO1、PDX1、GLUT2、GPR40蛋白表达情况。实验结果:1.miR-27a在肥胖胰岛素抵抗β细胞过度分泌胰岛素中的作用研究:生理生化指标结果显示,高脂饮食小鼠的体重、身体脂肪含量百分率,血糖、血脂及血清胰岛素含量均明显升高且有统计学差异(P0.01),高脂模型组肥胖小鼠OGTT、ITT曲线的整体趋势及曲线下面积大于低脂对照组小鼠且有统计学差异(P0.05),说明肥胖小鼠模型具有胰岛素抵抗的特点,模型制备成功。高脂模型组小鼠的GSIS曲线趋势及曲线下面积明显低于低脂对照组小鼠,HE染色及胰岛素免疫组化结果显示高脂模型组小鼠胰岛面积增加形态发生变化,胰岛素合成增多,同时与增殖及胰岛素合成分泌相关的蛋白PDX1、GLUT2、GPR40表达升高,表明胰岛β细胞出现增殖,胰岛素合成分泌水平升高,但是对于响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素的敏感性下降的现象。RT-PCR结果表明,与低脂对照组相比,高脂模型组胰岛组织中mi R-27a含量升高,Fox O1的mRNA含量降低,同时Fox O1蛋白表达降低(P0.05),说明肥胖胰岛素抵抗小鼠胰岛素合成分泌升高可能与miR-27a有关,同时miR-27a有可能是通过影响Fox O1发挥作用。高脂饮食喂养miR-27a慢病毒沉默小鼠模型结果显示,与高脂慢病毒空载组相比,高脂饮食喂养miR-27a慢病毒沉默小鼠的胰岛组织中miR-27a含量明显下降,说明miR-27a的过度表达成功被抑制,同时miR-27a慢病毒沉默小鼠的空腹胰岛素水平明显降低,FoxO1的m RNA含量有所回升(P0.05),进一步说明miR-27a可能以FoxO1为靶点在促进胰岛素分泌中发挥关键作用。综上,动物实验结果表明miR-27a可能参与肥胖胰岛素抵抗β细胞胰岛素分泌增加的过程,并且可能是通过调节Fox O1发挥作用。2.miR-27a通过调控FoxO1在β细胞过度分泌胰岛素中的分子机制研究:细胞水平实验首先验证转染效率,荧光显微镜图片显示转染组的转染效率均非常高,可以进行后续实验;上清液中基础累积胰岛素结果显示,单独过表达miR-27a组的胰岛素含量增加,同时过表达mi R-27a与Fox O1组的胰岛素含量降低,胰岛素分泌能量代谢关键指标ATP的检测结果也呈现了同样的趋势(P0.01)。葡萄糖刺激MIN6细胞的胰岛素分泌变化结果显示,过表达miR-27a时MIN6细胞对于高糖刺激分泌胰岛素的敏感性相比于对照组明显下降,而同时过表达miR-27a及FoxO1组中响应高糖刺激而分泌胰岛素的的敏感性则有了一定程度的改善。RT-PCR结果显示,在MIN6细胞中过表达miR-27a时,FoxO1的mRNA水平下降同时PDX1、GLUT2、GPR40的mRNA水平升高,而在同时过表达组中这种趋势则被逆转(P0.05)。蛋白水平结果显示,在过表达miR-27a组中,Fox O1的蛋白水平下降,PDX1、GLUT2、GPR40的蛋白表达水平升高,而在同时过表达miR-27a及FoxO1组中则出现了相反的趋势(P0.05)。细胞实验结果提示miR-27a可以通过抑制Fox O1促进基础胰岛素分泌,其机制可能是由于miR-27a抑制FoxO1的m RNA表达,从基因水平上调胰岛β细胞中增殖及胰岛素合成分泌相关蛋白PDX1-GLUT2/GPR40通路,进而促进胰岛素过度分泌。结论:miR-27a能够促进肥胖胰岛素抵抗下胰岛β细胞过度分泌胰岛素,其机制可能是通过抑制FoxO1的mRNA表达,进而上调胰岛素合成分泌相关蛋白PDX1-GLUT2/GPR40的mRNA及蛋白水平,促进胰岛β细胞胰岛素合成分泌增加,提示miR-27a可能是加速肥胖胰岛素抵抗胰岛β细胞失代偿的重要靶点。
【图文】：

曲线,葡萄糖耐量,胰岛素,小鼠

图 3.1 肥胖小鼠 12w 时葡萄糖耐量及胰岛素耐量结果LF:低脂对照组，HF：高脂模型组*P<0.05, **P<0.01 compared with LF groupA. 葡萄糖耐量曲线（OGTT） B. OGTT 曲线下面积 C. 胰岛素耐量曲线（ITT）D. ITT 曲线下面积3.1.3 肥胖胰岛素抵抗小鼠葡萄糖刺激的胰岛素分泌结果为了探究肥胖小鼠胰岛合成分泌胰岛素功能的变化，我们检测了葡萄糖刺激的胰岛素分泌情况。如图 3.2 结果显示，尽管 HF 组小鼠空腹基础胰岛素水平高于 LF 组小鼠（表 3.1），但其胰岛对于短时葡萄糖刺激而分泌产生的胰岛素较 LF组显著降低，同时曲线下面积也小于 LF 组，且有统计学差异（P<0.05），说明HF 组小鼠的胰岛对于口服短时葡萄糖刺激分泌胰岛素的敏感性较 LF 组小鼠明显下降。

曲线,胰岛素分泌,胰岛素抵抗,小鼠

图 3.2 肥胖胰岛素抵抗小鼠葡萄糖刺激的胰岛素分泌结果LF:低脂对照组，HF：高脂模型组*P<0.05 compared with LF groupA. 葡萄糖刺激的胰岛素分泌曲线（GSIS） B. GSIS 曲线下面积3.1.4 肥胖胰岛素抵抗小鼠胰岛形态学变化为了进一步探究肥胖小鼠胰岛形态学以及功能的变化，取肥胖小鼠胰岛固定切片进行了 HE 染色及胰岛素免疫组化实验。如图 3.3，HE 结果显示 LF 组正常胰岛为近似椭圆形或圆形，而 HF 组胰岛面积增加且轮廓形状趋于不规则，同时HF 组小鼠胰岛的形状因子（SF）明显大于 LF 组，说明其胰岛形态发生了变化。胰岛素免疫组化结果可见，HF 组的 Ins+/Isl 比值略大于 LF 组，，说明胰岛中具备分泌胰岛素能力的β细胞数量有一定增加。HF 组 IOD/ Isl 的比值约为 LF 组的两倍，提示 HF 组小鼠单位面积上胰岛细胞分泌胰岛素的负荷远大于 LF 组小鼠。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.1

【参考文献】