PI3K信号通路调控结节病中Treg稳态的机制研究

发布时间：2020-04-02 08:41

【摘要】：结节病是一种以非干酪样肉芽肿为主要特征,与Th1/Treg(Regulatory T cell)细胞免疫紊乱紧密相关的全身性多器官肉芽肿疾病,90%以上的结节病患者会累及肺部,因此也被称为肺结节病。肺结节病目前尚无针对发病机制的有效治疗手段。第一部分:白介素33改善肺结节病中Treg细胞紊乱的研究肺结节病患者支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和外周血中Treg细胞水平异常且功能缺陷。我们对肺结节病小鼠模型施用白介素33(Interleukin33,IL33)或抗白介素23(Interleukin23,IL23)抗体进行干预,通过流式细胞术(FACS)分析或实时定量PCR(qPCR)检测Th1/T helper 17 cell(Th17)/Tregs的平衡情况,以及Treg细胞免疫调节能力的变化,以此研究IL33或抗IL23抗体对肺结节病免疫紊乱的调节和对Treg细胞群稳态的影响。同时通过蛋白质印迹(Western Blot)检测PI3K/Akt和TGF-β/Smad2/Smad3信号通路中关键蛋白的表达,寻找此过程中可能发挥作用的关键信号通路。结果表明,IL33可以促进肺结节病小鼠模型Th1/Th17/Tregs的再平衡,增强结节病中受到损伤的Treg细胞的免疫调节能力。而IL33的调节作用可能是通过促进Treg细胞表面ST2(IL33受体)的过表达来实现的。此外,IL33促进肺结节病中Th1/Th17/Tregs再平衡的同时,有效地抑制了在结节病中异常活化的PI3K信号通路。结果提示:IL33可能通过抑制P13K信号通路,恢复肺结节病中Tregs稳态,再平衡Th1/Th2,发挥抗炎作用。PI3K信号通路可能对结节病中Treg细胞的稳态调节起到重要作用,因此设计了后续实验,对PI3K通路与结节病中Treg细胞之间调控关系进行进一步研究。第二部分:调控PI3K信号通路对肺结节病Treg细胞紊乱的研究PI3K/Akt信号通路对于维持Treg的体内平衡至关重要。活动期结节病患者PI3K/Akt信号通路异常激活。结合前期数据,我们选用了两种PI3K抑制剂(LY294002和BKM120),来调控PI3K信号通路,以调节结节病中Treg细胞水平和功能。采用FACS、qPCR和MACS免疫磁珠分选CD4+CD25+T细胞以检测其抑制功能等方法,检测PI3K抑制剂对结节病小鼠模型Th1/Th2、Treg/Th17细胞亚群紊乱的调节作用以及对Treg细胞增殖、分化和功能的影响。结果显示,在肺结节病模型小鼠的Treg细胞群中存在着PI3K/Akt信号通路的异常活化,同时Treg细胞的抑制功能受损。PI3K抑制剂可有效抑制肺内和Treg细胞中PI3K/Akt信号通路的活化,恢复结节病中受损的Treg细胞的免疫抑制功能,再平衡Th1/Treg,控制肺结节病的进展。我们的实验结果证明了抑制PI3K信号通路,可以有效地恢复肺结节病中Treg细胞的稳态。而BKM120较LY294002的作用效果更加显著,提示PI3Kp110γ在该调节过程中的重要作用。后续的实验将深入探寻PI3Kp11Oy在肺结节病发生发展中的作用,以寻找针对结节病发病机制的特异性药物。
【图文】：

Ｔ细胞分别计数，然后根据细胞浓将不同比例的细胞到１２孔板，入逡逑完全培养基进行培养，７２小时以后收取细胞并分析。逡逑２．１８统计学处理逡逑米用ＧｒａｐｈＰａｄ邋Ｐｒｉｓｍ邋７．０邋（ＧｒａｐｈＰａｄ邋Ｓｏｆｔｗａｒｅ，邋Ｌａ邋Ｊｏｌｌａ，邋ＣＡ，邋ＵＳＡ）软件进行数逡逑据分析，数据用均数±标准误来表示，各组间比较采用完全随机方法分析逡逑（Ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ），Ｐ邋＜邋０．０５认为差异有统计学意义。逡逑３．结果逡逑３．１邋Ｃ５７ＢＬ／６肺结节病小鼠模型的建立和鉴定逡逑参照临床上对结节病患者的给药时间，我们在对小鼠进行第一次敏化的第逡逑４４天（发病较晚期）给予小鼠ＩＬ３３或抗ＩＬ２３抗体进行干预（图１）。具体步骤见逡逑方法部分。逡逑

我们检测了肺结节病小鼠模型ＢＡＬＦ中的Ｔｒｅｇ细胞的数量和功能的变逡逑化情况．？与正常组比，结节病组小鼠的Ｔｒｅｇ细胞的数量显著升高，，但是免疫抑逡逑制能力却大幅下降（图３）。逡逑Ｉ邋３］逦｜６０１逦．逡逑４０－逡逑卜｜逡逑—0逦＾逦邋Ｉ逡逑Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ逦Ｃｏｎｔｒｏｌ邋°逦Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ逦Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑图３各组小鼠淋巴结中的Ｔｒｅｇ细胞的数量和抑制功能的流式统计结果（＊Ｐ＜０．０５，逡逑＊＊＊Ｐ＜０．００１．邋ｎ邋＝邋１０）逡逑３．２经过药物干预以后结节病中的Ｔｈｌ和Ｔｒｅｇ的变化逡逑ＩＬ３３可以有效地抑制在结节病中出现的Ｔｈｌ细胞群异常增多（１０．０３邋士逡逑３＿６５３邋％邋ｖｓ．邋２８．３８邋±５＿７１４邋％；邋Ｐ邋＜邋０．０１，ｑ邋＝邋４．１３１，ａｎｄ邋Ｐ邋＜０．０１．邋ｑ邋＝邋３．０６７），去Ｐ并不逡逑会改变原来就没有变化的Ｔｈ２细胞群的水平，抗ＩＬ２３在调节Ｔｈｌ型细胞紊乱的表逡逑８３逡逑
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R597

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本文编号：2611719