肥胖大鼠前额叶内质网应激—自噬相关的神经可塑性蛋白表达下降及运动的调节作用

发布时间：2020-04-02 14:49

【摘要】：研究目的动物及流行病学的研究都发现,肥胖症不仅会危害外周组织器官的生理功能,还能影响中枢神经系统(central nervous system,CNS),危害脑健康,引起认知功能障碍。高脂饮食及肥胖时首先会导致外周及中枢系统糖脂代谢紊乱,影响CNS的信号传导,引起神经元凋亡,损害脑组织结构和功能,降低认知功能,并增加患痴呆等神经退行性疾病的风险。因此,肥胖是诱发大脑疾病的重要风险因素。但目前对肥胖引起认知功能下降的原因仍未能全面了解,尤其是与认知功能关系最为密切的前额叶的影响仍缺乏相关研究。本研究通过观察高脂饮食诱导的肥胖大鼠前额叶内NMDAR1、N-AChR、SYN38、BDNF神经可塑相关蛋白表达的变化,以及肥胖大鼠的前额叶内是否发生内质网应激、自噬和凋亡以及相关信号通路变化,分析ERS、自噬及细胞凋亡是否为肥胖时神经可塑相关蛋白表达下降的主要机制。进而评价前额叶内质网应激及自噬在肥胖影响认知功能中的作用和机制。通过观察肥胖大鼠中等强度有氧运动后对上述现象的逆转效果。研究中等强度有氧运动对前额叶ERS、自噬和凋亡以及相关信号通路是否有改善作用,并探讨PPARγ在有氧运动增加NMDAR1、N-AChR、SYN38、BDNF的表达是否与改善前额叶ERS有关。研究方法研究一:使用7周龄雄性SD大鼠150只,普通饲料适应性喂养1周后,根据体重随机分为两组:(1)普通饲料组(NCD组,n=40),普通饲料喂养;(2)高脂饲料组(HFD组,n=110),高脂饲料喂养。喂养8周后,以高脂饲料组大鼠体重大于等于普通饲料组大鼠平均体重加1.4倍标准差为标准来筛选高脂膳食诱导肥胖大鼠(DIO),建立肥胖大鼠模型。第9周初,将普通饲料组大鼠和肥胖组大鼠根据体重随机挑选出一定数量的大鼠并分为四组:普通饲料安静对照组(CS组,n=12)、普通饲料运动组(CE组,n=12),肥胖安静组(OS组,n=12),肥胖运动组(OE组,n=12)。运动组大鼠进行为期8周的有氧运动。实验第17周末,各组大鼠禁食12h过夜,经麻醉处死后,下腔静脉取血5ml/只,并剥离大鼠前额叶组织,用蛋白抽提试剂盒抽提前额叶的膜蛋白、胞质蛋白和核蛋白。使用分光光度计检测大鼠血清中的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量,使用Western Blot检测大鼠前额叶内如下蛋白的表达水平:脂肪酸转运蛋白FATP1,ERS通路蛋白GRP78、p-PERK/PERK、p-IRE1α/IRE1α、p-eIF2α/eIF2α和ATF4,ERS介导凋亡发生的标志蛋白caspase-12、CHOP和p-JNK,反应抗凋亡能力的蛋白Bcl-2/Bax,自噬标志蛋白Beclin-1、LC3Ⅰ/Ⅱ,神经可塑性相关蛋白NMDAR1、BDNF、SYN和AchR,以及PPARγ信号通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-CREB/CREB及caspase9等。研究二:SPF级新生SD大鼠(出生24h以内),雌雄不限,分离出新生鼠前额叶细胞并培养6天。使用棕榈酸配制高脂培养基、并分别添加ERS抑制剂(4-PBA)、自噬抑制剂(3-MA)和PPARγ激动剂(罗格列酮),继续培养前额叶细胞24h,通过观察细胞的生长状态和流式细胞仪检测细胞凋亡率,确定不同培养基的最佳使用浓度。之后实验分为五组:(1)正常对照组(C组):Neurobasal无血清培养基;(2)高脂组(PA组):添加0.5 mM棕榈酸的Neurobasal培养基;(3)ERS抑制剂组(4-PBA组):在0.5mM棕榈酸的Neurobasal培养基中加入5 mM的4-PBA;(4)自噬抑制剂组(3-MA组):在0.5 mM棕榈酸的Neurobasal培养基中加入2.5 mM的3-MA。(5)PPARγ激动剂组(Rosi组):在0.5 mM棕榈酸的Neurobasal培养基中加入40μm的Rosi。继续培养细胞24h,收集细胞,用Western Blot检测前额叶细胞内研究一中相关蛋白的表达情况。研究结果研究一:1.高脂饲料组大鼠经8周高脂膳食后,其体重显著高于普通饲料组大鼠(p0.01),符合肥胖标准的大鼠有63只,肥胖建模成功率为57.27%(63/110)。与普通饲料组大鼠相比,肥胖大鼠血清中TG、TC和LDL-C的浓度显著升高(p0.01),HDL-C浓度显著降低(p0.01)。2.经8周有氧运动干预后,OE组大鼠的摄食量、体重均显著低于OS组大鼠(p0.01),血清中的TG、TC和LDL-C的浓度浓度也显著降低(p0.01),HDL-C浓度显著升高(p0.01)。3.FATP1(F(1,20)=43.14,p0.01)的蛋白表达水平有显著的交互效应。Post-hoc结果表明,OS组大鼠FATP1含量显著性高于CS组(p0.01)。8周有氧运动干预后,OE组大鼠前额叶内FATP1含量显著性低于OS组(p0.01)。4.与CS组比较,OS组GRP78表达、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比值显著升高(p0.01);与OS组相比,OE组GRP78表达、p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α(p0.01)比值显著下降(p0.01);OE与CS相比,p-eIF2α/eIF2α比值显著升高(p0.05),GRP78、p-PERK/PERK指标无显著差异。统计结果显示,p-IRE1α/IRE1α(F(1,20)=22.60,p0.01)、ATF4(F(1,20)=4.582,p0.05)有显著的饮食主效应,ATF4(F(1,20)=69.47,p0.01)有显著的运动主效应,但均无交互效应。5.Beclin-1(F(1,20)=15.38,p0.01)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(F(1,20)=7.999,p0.05)均有显著的饮食主效应,但均无运动主效应,也无交互效应。6.与CS组比较,OS组caspase12、CHOP的表达和Bax/Bcl-2比值显著升高(p0.01);与OS组相比,OE组caspase12和CHOP表达及Bax/Bcl-2比值显著降低(p0.01);OE与CS相比,CHOP(p0.01)及Bax/Bcl-2(p0.05)表达水平显著升高。统计结果显示,p-JNK(F(1,20)=21.69,p0.01)有显著的饮食主效应,但没有显著的运动主效应和交互作用。7.与CS组比较,OS组BDNF和SY38表达水平显著降低(p0.01);与OS组相比,OE组BDNF和SY38表达无显著性差异;OE与CS相比,BDNF和SY38表达也无显著性差异。然而,AChR(饮食主效应F(1,20)=21.99,p0.01,运动主效应F(1,20)=13.69,p0.01)均有饮食和运动主效应,但无显著交互效应。8.PPARγ(饮食主效应F(1,20)=44.12,p0.01,运动主效应F(1,20)=11.99,p0.01)均有饮食和运动主效应,但无显著交互效应。p-PI3K/PI3K(饮食主效应F(1,20)=15.23,p0.01,运动主效应F(1,20)=15.47,p0.01)均有饮食和运动主效应,但无显著交互效应。与CS组比较,OS组p-Akt/Akt(p0.01)表达水平显著降低;与OS组相比,OE组p-Akt/Akt(p0.05)表达显著升高,OE组与CS相比,p-Akt/Akt表达无差异;caspase9(饮食主效应F(1,20)=10.63,p0.01,运动主效应F(1,20)=6.208,p0.05)和p-CREB/CREB(饮食主效应F(1,20)=154.8,p0.01,运动主效应F(1,20)=233.9,p0.05)均有饮食和运动主效应,但caspase9和p-CREB/CREB表达均无显著交互效应。研究二:1.在培养的前额叶细胞中加入不同浓度PA处理细胞,发现,0.5m M PA可以显著诱导细胞凋亡发生,且细胞凋亡率呈剂量依赖的效应曲线。对培养的前额叶细胞进行不同干预发现,PA组细胞凋亡率(19.53±1.35)显著高于C组(1.47±0.32,p0.01);与PA组相比较,5m M 4-PBA组(6.0±0.39)、20μM Rosi组(11.8±0.97)和40μM Rosi组(6.56±0.33)细胞凋亡率显著降低(p0.01),而2.5m M 3-MA组(47.6±1.25)、5m M 3-MA组(60.5±4.25)和10m M 4-PBA组(45.3±2.57)则显著升高(p0.01)。2.与C组相比,PA组(p0.05)的FATP1表达均显著升高,与PA组相比,4-PBA、3-MA、Rosi各组的FATP1表达无差异。3.与C组相比,PA组GRP78(p0.05)、p-IRE1α/IRE1α、p-PERK/PERK、p-e IF2α/e IF2α、、ATF4、P-JNK、CHOP和caspase12表达显著升高(p0.01);与PA组比较,4-PBA组GRP78(p0.05)、p-IRE1α/IRE1α(p0.01)、p-PERK/PERK(p0.05)、p-e IF2α/e IF2α(p0.01)和ATF4(p0.01)、P-JNK(p0.01)、CHOP(p0.01)和caspase12(p0.01)表达显著降低;3-MA组GRP78(p0.05)、p-PERK/PERK(p0.05)和CHOP(p0.01)显著升高,p-IRE1α/IRE1α比值显著降低(p0.01);Rosi组GRP78(p0.05)、p-IRE1α/IRE1α(p0.01)、ATF4(p0.05)、P-JNK(p0.05)、CHOP(p0.05)和caspase12(p0.01)的水平显著降低。4.与C组相比,PA组Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著升高(p0.01),与PA组相比,4-PBA组Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著降低(p0.01);3-MA组Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著降低(p0.01),而Rosi组自噬指标无显著差异。5.与C组相比,PA组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-CREB/CREB比值显著降低(p0.01),Bax/Bcl-2和caspase9显著升高(p0.01);与PA组相比较,4-PBA组的p-CREB/CREB比值显著升高(p0.05),3-MA组PPARγ(p0.01)、p-PI3K/PI3K(p0.05)、p-Akt/Akt比值(p0.01)均显著降低,caspase9显著升高(p0.01);Rosi组PPARγ、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-CREB/CREB比值均显著升高(p0.01),Bax/Bcl-2比值、caspase9的表达均显著降低(p0.01)。6.与C组相比,PA组NMDAR1、SYN、BDNF和ACh R的表达均显著降低(p0.01),与PA组相比,4-PBA组SYN(p0.05)、BDNF(p0.01)的表达显著升高;3-MA组各蛋白表达无显著差异;Rosi组SYN(p0.05)、BDNF(p0.01)和ACh R(p0.05)的表达均显著升高。结论:1.在体研究表明,高脂膳食能诱导SD大鼠肥胖,并导致血脂异常,并促进肥胖大鼠前额叶FATP1的蛋白表达,将转运过多的脂肪酸进入脑细胞,诱发大鼠前额叶ERS,使内质网加工合成蛋白质的功能减弱,持续的ERS引起细胞凋亡发生,在体和离体研究均表明,前额叶细胞发生ERS时会抑制PPARγ、p-PI3K、p-Akt及p-CREB等蛋白表达,这些因素共同作用最终降低了肥胖大鼠前额叶内神经可塑性相关蛋白的表达。2.有氧运动干预能改善肥胖大鼠的血脂异常,降低前额叶内FATP1的蛋白表达,缓解前额叶ERS,降低细胞凋亡相关蛋白的表达,通过激活PPARγ信号通路促进PI3K、Akt及CREB等蛋白活化,最终增加SYN、BDNF和ACh R等神经可塑性相关蛋白的表达。3.离体研究表明,棕榈酸诱导的前额叶ERS会伴随自噬水平增加,自噬的激活对ERS及其介导细胞凋亡起到抑制的作用。使用激活剂激活PPARγ及其介导的信号通路,可缓解ERS及其介导的细胞凋亡发生,PPARγ的激活对细胞具有保护作用,抑制ERS和激活PPARγ信号通路可促进SYN、BDNF和ACh R等神经可塑相关蛋白的表达。
【图文】：

肥胖大鼠前额叶神经可塑性蛋白表达下降与内质网应激 -自噬的关系及运动的调节作用BDNF 的表达是否与改善前额叶 ERS 及 PPARγ 通路活化有关。这些问题的解决既可以进一步揭示肥胖致大鼠前额叶损伤的分子机制，又可以揭示运动改善肥胖所致大鼠前额叶损伤的分子机制，，有利于深入认识肥胖、脑健康和运动的关系。

在体研究技术路线图
【学位授予单位】：上海体育学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R589.2

【参考文献】

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本文编号：2612093