升高中枢脑脊液瘦素水平对兔骨质疏松的影响

发布时间：2020-04-09 07:42

【摘要】：目的:通过对兔双侧卵巢切除联合甲泼尼龙琥珀酸钠建立兔骨质疏松模型,经枕骨大孔向小脑延髓池注射重组兔瘦素蛋白提高脑脊液瘦素水平,观察兔双侧股骨骨密度变化,同时检测血清中生长激素、胰岛素样生长因子-1和骨钙素水平变化,及血钙、碱性磷酸酶和血磷浓度变化,以及瘦素受体、骨钙素、骨形成蛋白-2在下丘脑以及骨钙素、骨形成蛋白-2、I型胶原交联在股骨中的表达,探索脑脊液瘦素水平的升高对兔双侧卵巢切除联合甲泼尼龙琥珀酸钠诱导的骨质疏松的影响。方法:第一部分:5月龄大小新西兰白成年雌兔36只,随机分为建模组(n=30)和假手术组(n=6),建模组动物全麻后行双侧卵巢切除术,并于术后起每日肌注甲泼尼龙琥珀酸钠(1mg/kg),连续8w,制备兔骨质疏松模型;假手术组仅开腹游离出双侧卵巢即关闭腹腔,术后起每日肌注等量生理盐水,连续8w。制备模型前(0w)和第8w,所有动物行双能X线仪扫描测定兔双侧股骨骨密度(BMD);第0、2、4、8w,动物空腹下经兔耳缘静脉取血2ml,测定血钙(Ca)、雌二醇(E2)水平变化。第二部分:骨质疏松模型制备成功后,建模组30只动物随机分成对照组(A)、生理盐水组(B)、低剂量瘦素组(C)、中剂量瘦素组(D)和高剂量瘦素组(E),每组6只。建模成功后第0、3、7d,对照组动物在全麻下仅经枕骨大孔小脑延髓池穿刺,生理盐水组小脑延髓池内注射生理盐水0.05ml,低剂量组小脑延髓池内注射0.01μg/μl重组瘦素蛋白溶液0.05ml,中剂量组注射0.1μg/μl瘦素0.05ml、高剂量组则注射1.0μg/μl瘦素0.05ml。动物于中枢瘦素给药前(0d)和给药后第28d、56d行双能X线仪扫描测定双侧股骨骨密度(BMD);第0、3、7、14、28、42、56d清晨空腹取静脉血2ml,酶联免疫吸附法检测脑脊液瘦素(LEP)浓度和血清生长激素(GH)、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、血骨钙素(OC)浓度,生化仪检测血钙(Ca)、碱性磷酸酶(ALP)和血磷(P)浓度。第56d牺牲所有动物,PCR测定脑组织内瘦素受体(OB-R)和骨组织骨形成蛋白-2(BMP-2)、Ⅰ-型胶原(Col-Ⅰ)的表达情况;免疫组织化学染色分别观察脑组织和骨组织内骨钙素(OC)和骨形成蛋白-2(BMP-2)的表达情况。结果:(1)建立兔骨质疏松模型:术后第8w建模组BMD明显下降;第2w、4w、8w建模组血E2持续下降,血Ca持续升高,假手术组BMD、血E2和血Ca均无明显变化。(2)升高脑脊液瘦素浓度对骨质疏松的影响:中枢给药后第3、7d低、中、高剂量组脑脊液LEP水平显著升高,且呈剂量依赖性,后逐渐回落。中枢给药后第28、56d低、中、高剂量组BMD逐渐升高,且与给药剂量呈剂量依赖性;第7、14、28d低、中、高剂量组血清GH水平持续升高,且呈剂量依赖性;后逐渐回落;第14、28d低、中、高剂量组血IGF-1持续升高,且呈剂量依赖性;后逐渐回落;第28、42、56d高、中剂量组组血清OC水平持续升高;第14、28、42、56d低、中、高剂量组血Ca轻度降低;第7、14d低、中、高剂量组血P轻度降低;第14、28、42、56d低、中、高剂量组血ALP水平降低,且呈剂量依赖性。第56d脑OB-R m RNA表达量各组间无差异;低、中、高剂量组骨BMP-2和Col-Ⅰm RNA表达明显升高,且呈剂量依赖性;免疫组化染色显示各组脑组织BMP-2和OC均无明显阳性表达;低、中、高剂量组骨组织BMP-2和OC表达明显升高,且呈剂量依赖性。结论:(1)对5月龄雌兔行双侧卵巢切除联合肌注甲泼尼龙琥珀酸钠8w,其血雌二醇水平明显下降,血钙水平升高,股骨骨密度降低,成年性成熟雌兔行双侧卵巢切除联合肌注甲泼尼龙琥珀酸钠8w,可有效的制备兔骨质疏松模型。(2)对兔骨质疏松模型经枕骨大孔向小脑延髓池内注射瘦素提高中枢瘦素浓度后,血清GH、IGF-1、OC水平升高,血Ca、P、ALP水平降低,双侧股骨骨密度显著升高,OB-R、BMP-2、OC在脑组织中未见明显表达,BMP-2、OC在骨组织中表达显著升高。提示中枢瘦素可通过下丘脑-垂体轴作用于骨组织,促进成骨代谢,减少骨质流失和逆转双侧卵巢切除联合甲强龙导致的兔骨质疏松发生,且呈剂量依赖性。
【图文】：

双侧卵巢切除,双子宫,卵巢,膀胱

6图 1 双侧卵巢切除a：切开皮肤以及皮下，，切口长约 3cm；2b：从膀胱附近找到呈串珠样的兔双子；1c：向上游离找到卵巢；1d：切除兔卵巢。.1.4 双侧股骨骨密度的测定所有动物均于制备兔骨质疏松模型前（0w）和制备模型第 8w，动物在禁食2h后，经盐酸赛拉嗪和氨基甲酸乙酯麻醉，取仰卧位固定，用双能X线仪（DEXA

瘦素,时间点,和血,对照组

software 绘图。检验水准α值取双侧 0.05。1.2 结果1.2.1 兔血清中雌二醇、血钙变化情况经化学发光仪检测不同时间点两组血清中雌二醇(E2)浓度结果见表 1 和图2，经统计分析建模组和假手术组去势后各时间点血清中雌二醇水平差异有统计学意义。表 1 假手术组和建模组不同时间点兔血 E2 浓度变化( x±s, pg/ml, n1=6,n2=30)0w 2w 4w 8w假手术组 21.000±1.414 20.500±1.871 19.667±1.506 21.167±1.722建模组 21.900±2.171 12.267±1.507* 8.100±1.348* 3.133±1.408*统计值t =0.969，P=0.339t =-11.757，P=0.000t =-18.846，P=0.000t =-27.652，P=0.000注：t 为建模组与假手术组比较运用独立样本t检验分析所得t值* 为建模组与假手术组比较差异有显著性经全自动生化仪检测不同时间点两组血钙(Ca)浓度结果见表 2 和图 2，经统计分析后建模组和假手术组去势前与去势后第 2w 血钙水平未见显著性差异，去
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R580

【参考文献】