肠道微生物Bacteroides coprocola单核苷酸突变与2型糖尿病的关联研究

发布时间：2020-04-09 13:52

【摘要】：糖尿病患者数量在过去几十年间迅速增加,中国人群的患病率约为11.6%,其中2型糖尿病占90%,2015年糖尿病成为了第六大主要致残因素。2型糖尿病主要特点是胰岛β细胞功能障碍和胰岛素抵抗所导致的胰岛素相对不足。尽管越来越多的2型糖尿病风险因素和改善其发展进程的机理被人们所揭示,但2型糖尿病的发病率仍在不断增长。人体肠道微生物与宿主之间在长期的共进化过程中形成了一种互利共生的关系,宿主长期的饮食习惯以及生理上的特征对于肠道菌群的种类和丰度都会造成很大的影响,另一方面,肠道菌群的生理活动同时又会影响宿主的健康状态。人体肠道微生物对于人体有益的功能主要在营养代谢和免疫防御等方面。近年来多项研究显示肠道菌群紊乱与超过五十种疾病有关,包括糖尿病、动脉粥样硬化、肝硬化、抑郁症和心衰等。随着对肠道微生物的不断深入研究,肠道菌群在2型糖尿病发生发展以及治疗中的作用显得越来越重要。研究发现2型糖尿病的发生伴随着短链脂肪酸产生菌的减少和机会致病菌的增加。另有研究使用中药复方葛根芩连汤治疗2型糖尿病患者后发现,2型糖尿病患者的肠道菌群有显著变化,且菌群的改变早于症状的改善,这一结果提示葛根芩连汤治疗2型糖尿病可能是通过改变肠道菌群来发挥作用的。虽然2型糖尿病与肠道微生物的相关性已经被广泛报道,但目前的研究依旧停留在对肠道微生物结构和丰度的研究,尚未深入到菌株基因层面,更没有对菌株基因功能差异带来的蛋白的功能不同做研究。另外,目前也没有直接从粪便基因组中扩增目的基因的方法。因此本研究首先建立了一套直接从粪便基因组中扩增目的基因的方法,并分析了2型糖尿病患者和健康人的目的基因的差别,同时分析了这种差异所带来的蛋白功能的不同。首先建立了本地引物比对数据库。该数据库包含了2017年6月之前NCBI数据库中包含的所有细菌基因的测序数据。我们以此数据库做为检验所设计引物的特异性的比对数据库,引物设计选用NCBI-PRIMER在线引物设计软件,要求所设计的引物必须针对目的基因完全特异,使用BLAST工具筛选只能和目的基因匹配的引物。其次选择PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增方法,由于肠道宏基因组数量非常庞大,而且菌种序列相似性很高,通过一次PCR的方式从肠道宏基因组中直接扩增目的基因存在很大的困难,因此选用巢氏PCR对目的基因做了扩增。扩增产物进行Sanger测序,对测序结果进行进化树分析和突变位点统计,并做氨基酸注释。进化树分析结果发现2型糖尿病患者和健康人群中肠道微生物B.coprocola的EDU99824.1存在显著差异,进一步统计突变位点发现健康人中的EDU99824.1基因主要是野生型或第879位碱基由A变为G,而2型糖尿病患者的EDU99824.1基因第880位碱基由C变为T。进一步对碱基突变结果做了氨基酸注释后发现,健康人中的第879位突变属于同义突变编码谷氨酸,2型糖尿病患者的第880位突变属于错义突变,编码的氨基酸(第294位氨基酸)由脯氨酸变为丝氨酸。在分析基因序列时我们发现,健康人和2型糖尿病患者中B.coprocola在第879位和第880位的多克隆株同时存在,即在某一个样本中野生型和突变株同时存在。为了进一步研究基因突变对EDU99824.1编码蛋白的功能的影响,我们针对EDU99824.1基因所编码的糖苷酶做了体外活性检测实验。首先构建原核表达载体,将EDU99824.1基因的野生型和突变株连接到质粒载体中,然后转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中进行表达,最后使用纯化柱纯化目的蛋白,Western blot结果显示顺利纯化出目的蛋白。使用对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)和京尼平苷作为底物检测EDU99824.1糖苷酶的活性,酶活性检测结果显示纯化出的蛋白对两个底物均有活性,野生型和第879位突变株对pNPG的活性没有统计学差异,而第880位突变株对pNPG的酶活性远高于野生型和第879位突变株。以京尼平苷为底物检测酶活性发现三种突变株对京尼平苷的酶活性按野生型、第879位突变株和第880位突变株的顺序依次升高。该结果显示2型糖尿病患者中的B.coprocola的EDU99824.1糖苷酶相比于健康人能产生更多的葡萄糖,我们猜测这种突变可能参与了2型糖尿病的发生和发展。为了深入分析基因突变给酶活性带来影响的原因,我们在Expasy SWISS-MODEL服务器上做了蛋白三维结构模拟。模拟结果发现第294位氨基酸位于蛋白三维结构的最外围,推测氨基酸由非极性脯氨酸变为极性丝氨酸可能增加了酶对底物的亲和性,进而增加了酶活性。我们的研究工作在宏基因组领域首次揭示肠道微生物B.coprocola的EDU99824.1基因的单核苷酸突变与2型糖尿病有关,并发现这种突变改变了糖苷酶的活性,同时首次发现B.coprocola在人群中的多克隆现象。上述结论从基因层面揭示了肠道微生物与疾病的关联关系,为宏基因组研究提供了新的视角。
【图文】：

数据库作为检验设计引物特异性的比对数据库。其次为了减少背景量让引物特异地找到目的模板，选择巢氏 PCR 作为扩增方式。引物设计软件选用 NCBBLAST-Primer 在线设计，一次 PCR 引物不做特异性检验，产物作为二次 PCR 引物设计的模板，二次 PCR 为特异性引物，在数据库中只能唯一匹配目的模板。PCR产物进行 Sanger 测序。为了增加测序产物的长度，我们对固定区段设计了两对引物做测序结果拼接。测序结果分析分两个步骤，首先是进化树分析，从统计学上寻找 2 型糖尿病患者和健康人 EDU99824.1 基因的差异，其次统计所有样本中突变碱基的位置和类型，并做氨基酸注释，推测突变对功能可能造成的影响。为了进一步研究这种突变对功能的改变，我们构建了一个含有目的基因的原核表达载体并转化到大肠杆菌中，通过扩大培养表达 EDU99824.1 糖苷酶。表达的糖苷酶纯化后做体外活性试验，，以研究 2 型糖尿病患者和健康人中 EDU99824.1 基因的差异在其表达糖苷酶功能上有何不同。为了推测功能差异可能的原因，我们通过蛋白质三维结构模拟来预测野生型和突变株在结构上的不同。以下是整个工作的研究路线流程图：

图 3.1 EDU99824.1 进化树分析和突变位点分析3.3 点突变与 2 型糖尿病的关系与多克隆现象3.3.1 点突变与 2 型糖尿病的关系为了进一步探究 879 位点和 880 位点突变与 2 型糖尿病的关系，我们对突变位点翻译的氨基酸做了分析，如图 3.2 所示。A 图依次是没有发生突变的野生型，第 879 位碱基发生突变和第 880 位碱基发生突变的样本 Sanger 测序峰图，以及对应的碱基序列和翻译出来的氨基酸序列，我们发现了一个有趣的现象，以健康人为主的 879 位点的突变是由 A 变为了 G，对应氨基酸为第 293 位氨基酸没有发生变化属于同义突变，而以 2 型糖尿病患者为主的 880 位点的突变是由 C 变为了 T，对应氨基酸为第 294 位氨基酸由非极性的脯氨酸变为了极性的丝氨酸，属于错义突变。B 图是发生相应突变类型的样本数，并对三种突变类型做了两两 OR（Oddsratio）计算，计算结果发现三个 OR 值都有显著差异，说明野生型和两种突变类型都与 2 型糖尿病有关，其中野生型和第 880 位突变株之间的 OR 值最大为 5.53，
【学位授予单位】：军事科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.1

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本文编号：2620835